小叶黑柴胡药学研究综述

张东佳，彭云霞，王国祥，蔺海明

（1. 甘肃省农业科学院中药材研究所，甘肃 兰州 730070；

2. 甘肃省农业科学院经济作物与啤酒原料研究所，甘肃 兰州 730070；

3. 甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070）

小叶黑柴胡（Bupleurum smithii Wolff var.parviforlium Shan et Y.Li）为伞形科（Umbelliferae）柴胡属（Bupleurum）多年生草本植物，产于甘肃、内蒙古、宁夏、青海等省区。生长在海拔2 700～3 700 m 的山坡草地，偶见于林下［1］。在甘肃、宁夏、青海等地称为黑柴胡，作柴胡用［2-3］，以其干燥根或根茎入药，有解表退热、舒肝解郁之功效，用于感冒发热、寒热往来、疟疾、胸肋胀满［4］。现将小叶黑柴胡化学成分、质量控制、药理作用等药学方面的研究综述如下。

1 化学成分

1.1 挥发油

郭济贤等以气相色谱质谱联用从小叶黑柴胡中鉴定出了30 种挥发油成分。主要有α- 蒎烯、β- 蒎烯、2- 甲基环戊酮、α- 侧柏烯、β- 侧柏烯、柠檬烯、冰片烯、α- 葑烯、月桂烯、δ-3- 蒈烯、2，6- 二甲基辛烷、长叶薄荷酮、桃金娘烯醇、α- 萜品醇、萜品烯醇-4、牻牛儿醇、n-十一（碳）烷、n- 十三（碳）烷、荜澄茄油烯、γ- 荜澄茄烯、δ- 荜澄茄烯、α- 胡椒烯、葎草烯、α- 法呢烯，β- 红没药烯、β- 榄香烯、γ、榄香烯、十四（烷）酸、十七（碳）烷［5］。王燕萍用超临界萃取- 气相色谱—质谱联用分析了甘肃产柴胡的挥发性成分，从小叶黑柴胡中分离鉴定出47 个化合物，占挥发油总量的69.25%。其中主要成分为顺-9，12- 十八碳二烯酸（相对含量为12.10%）、Falcarinol（相对含量为11.64%）、油酸（相对含量为5.62%）；另外，酞酸二异丁酯、十六烷酸、硬脂酸等亦占较大比例。黄花鸭趾柴胡与小叶黑柴胡的挥发油成分均以十六烷酸、油酸、酞酸二丁酯、顺-9，12-十八碳二烯酸、硬脂酸为主，从而证实两者具有较为近似的临床作用［6］。

1.2 皂苷

周伟等从小叶黑柴胡茎叶部分分离鉴定出了5，7，4’-三羟基-3’-甲氧基黄酮醇-3-O- 芸香糖苷（水仙苷）、5，7，3’，4’-四羟基黄酮醇-3-O-芸香糖苷（芦丁）、异鼠李素、5，7，4’- 三羟基-3’- 甲氧基黄酮醇-3-O-α-L- 阿拉伯呋喃糖苷（广寄生苷）、槲皮素等5 种化合物，均系首次从该植物中分离获得［7］。罗何生等从小叶黑柴胡根中分离得到5个化合物，分别为3β，16β，23，28-四羟基齐墩果- 11、13（18）-二烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基1→6- ［β-D-吡喃葡萄糖基1→2］-β-D-吡喃葡萄糖苷，为新化合物，命名为柴胡皂苷p（Saikosaponin p）、柴胡皂甙元D、柴胡皂苷G、柴胡次皂苷H 和柴胡皂甙b2，它们均属首次从小叶黑柴胡中获得［8］。马立斌等从小叶黑柴胡分离出一种化合物3β，16β，23，28-四羟基齐墩果烷-11，13（18）-二烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-β-D- 吡喃葡萄糖基- （1→6）- ［β-D- 吡喃葡萄糖基- （1→2）］-β-D- 吡喃葡萄糖苷，命名为柴胡皂苷O（Saikosapnin O）［9］。王英华等自小叶黑柴胡根中分得5 个三萜皂苷和2 个三萜皂苷元，分别为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b4、Chikusaikoside I 和柴胡皂苷元F、柴胡皂苷元G，亦均为首次从该植物中分离得到［10］。

2 有效成分提取工艺

张丹等采用单因素试验与正交试验相结合优化小叶黑柴胡总皂苷的提取工艺，证明小叶黑柴胡总皂苷的较优提取工艺条件为料液比1∶10，乙醇浓度80%，提取次数3 次，提取时间1 h，提取温度80 ℃，提取溶剂pH 为9，该工艺下小叶黑柴胡总皂苷的得率为2.78%［11］。熊晗晖等以提取溶剂、提取次数、提取时间3 个因素，每个因素选择3 个水平设计正交实验方案，以总黄酮含量、浸膏得率的加权值为综合评价指标，紫外可见分光光度法测定有效成分含量，考察小叶黑柴胡地上部分有效成分的最佳提取工艺，结果表明采用85%乙醇提取3 次，提取2 h 的效果最佳［12］。

3 含量测定和质量控制

3.1 含量测定

周亚福等采用可见光分光光度法，对小叶黑柴胡等5 种柴胡属植物根、茎、叶及果实中总皂苷及总黄酮的积累规律进行比较研究，其中小叶黑柴胡根总皂苷含量最高，达0.66%，根和叶总皂苷的含量均比北柴胡、狭叶柴胡高［13］。汤芳玲等建立了超高效液相色谱法检测小叶黑柴胡的根中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 含量的方法，使用AC QUITY UPLC BEHTMC18 色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，检测波长203 nm，柱温30 ℃。柴胡皂苷a 线性范围为0.059～1.180 μg，平均回收率为96.7%；柴胡皂苷d 线性范围为0.112～2.230 μg，平均回收率为98.7% ［14］。张府君等用薄层色谱法对采自山西省6 个地区的黑柴胡药材进行了鉴别，按照薄层色谱法进行试验，吸取经过处理的供试溶液和对照品各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚- 乙酸乙酯为展开剂展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60 ℃加热3 min 后，置紫外光灯（365 nm）下检视，斑点显色清晰，黑柴胡药材薄层色谱中与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点［15］。刘来正等采用高效液相色谱法同时测定黑柴胡药材中柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 含量，色谱柱为Inertsil C18，流动相为乙腈- 水，检测波长为210 nm，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的进样量分别在0.425～6.375 μg 和0.130～3.250 μg，与各自峰面积积分值呈良好线性关系，精密度、稳定性和重复性试验的RSD＜2%，平均加样回收率分别为96.66%和96.20% ［16- 17］。汤芳玲等用超高效液相色谱法（UPLC）检测不同产地、不同部位小叶黑柴胡中黄酮含量，以芦丁、槲皮素、异鼠李素为指标成分，三者含量之和作为黄酮总量，对采自青海、内蒙古的小叶黑柴胡黄酮总量进行测定，并对青海门源、青海祁连山和内蒙赤峰3 个产地的小叶黑柴胡全草分为与根相连部位茎叶、中间部位茎叶、花穗部分3 部分进行黄酮含量的分析，表明从与根相连部位的茎叶到花穗部位，黄酮含量差异较大，且黄酮含量呈增高趋势，花穗部位黄酮含量最高［18］。曹纬国等采用分光光度法测定青海产小叶黑柴胡中总皂苷的含量，采用高效液相色谱法测定小叶黑柴胡中柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d的含量，得出小叶黑柴胡中总皂苷含量＞2.77%，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的含量分别高于0.54%和0.14%，其中柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的含量远高于中国药典中柴胡含量项下的标准［19］。黄鹤慧等以Kromasil C18 为色谱柱，流动相为乙腈-水（18∶82），流速为10 mL/min，检测波长为260 nm，测定了青海产小叶黑柴胡茎叶中芦丁的含量，建立了高效液相色谱法测定小叶黑柴胡茎叶中芦丁含量的方法，其中芦丁的线性范围0.200～2.000 μg，平均回收率99.69%［20］。林东昊等建立了RPHPLC 法，采用C18 色谱柱，以乙腈- 水为流动相进行梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长210 nm，分离和测定中国23 种61 个产地的柴胡属植物样品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d 的含量，不同种柴胡以及相同种、不同产地柴胡中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d 含量差异悬殊；所建立的HPLC 方法适用于柴胡属植物中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d 定量分析［21］。周伟等以Kromasil C18 为色谱柱，流动相为甲醇- 0.4%磷酸溶液，流速为1.0 mL/min，检测波长为256 nm，建立高效液相色谱法测定小叶黑柴胡茎叶中槲皮素、异鼠李素含量的方法，槲皮素的线性范围为0.08～0.40 μg，平均回收率为101.02%；异鼠李素的线性范围为0.06～0.30 μg，平均回收率为101.26% ［22］。窦后松等建立了小叶黑柴胡中kaerophyllin 的含量HPLC 测定方法，色谱柱Shimpack CLC ODS C18，流动相甲醇- 水（70∶30），流速1.0 ML/min，紫外检测波长328 nm，平均回收率为97.1% ［23］。

3.2 质量控制

刘来正等考察了不同黑柴胡药材的横切面显微特征和粉末特征，修订了黑柴胡药材的性状特征和显微特征，建立了TLC 鉴别黑柴胡的方法，并对10 批黑柴胡药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物进行检查，测定了活性成分含量。黑柴胡的水分限度≤10.0%、总灰分≤9.0%、酸不溶性灰分≤3.1%、浸出物的含量≥15%、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的总质量分数≥0.2%［17］。张妤等按照2010 年版《中国药典》的方法，测定黑柴胡药材中水分、灰分和浸出物的含量，含水量均低于7.44%，乙醇浸出物量均高于17.07%，总灰分低于7.90%，酸不溶性灰分低于2.80%，并建议以上述数据作为黑柴胡质量控制标准［24］。汤芳玲等通过检测10 批小叶黑柴胡药材，建立其UPLC 指纹图谱，内蒙海拉尔、青海海宴县2 个产地的药材相异度较高，两产地药材共有峰的相对保留时间RSD＜3%，相对保留峰面积有较大的差异，表明不同的地理位置和气候条件可能对药材的成分组成和含量存在一定的影响；标定了28 个共有峰，非共有峰占总峰面积的10%以下，符合指纹图谱测定的技术要求［25］。刘鄂湖等以Kromasil C18为色谱柱，流动相为乙腈- 水梯度洗脱，体积流量1.0 mL/min，检测波长260 nm，建立了小叶黑柴胡药材的HPLC 指纹图谱，确定了14 个共有峰，共有峰相对保留时间的RSD 为0.02%～1.49%，相对峰面积的RSD 为6.12%～58.75%，10批样品的相似度均大于0.9［26］。

4 药理作用

4.1 解热镇痛

赵玉珍等研究发现，小叶黑柴胡水煎剂与粗皂苷对菌苗致热家兔有明显解热作用［27］。粗皂苷对小鼠扭体有明显镇痛作用，乙醚提取物与粗皂苷对二甲苯所致小鼠耳壳肿胀和角叉菜胶致小鼠足跖肿胀均有明显抑制作用，这些作用与相同剂量的北柴胡间无显著差异，二者间的急性毒性亦无显著差异。赵玉珍等又发现小叶黑柴胡粗皂苷对小鼠四氯化碳致肝损伤有显著的保护作用，乙醚提取物对冰醋酸所致小鼠扭体有明显的镇痛作用，这些作用与相同剂量的北柴胡相仿［28］。

4.2 抗炎和免疫调节

武剑等收集KM 小鼠腹腔巨噬细胞，用不同浓度的小叶黑柴胡多糖溶液（10、100、200 mg/L）刺激，检测巨噬细胞吞噬E.coli、趋化和分泌NO的功能。各浓度组均能显著促进巨噬细胞吞噬E.coli 和趋化作用，但对巨噬细胞分泌NO 无明显影响；小叶黑柴胡多糖100、200 mg/L 可明显抑制脂多糖诱导的巨噬细胞分泌NO。表明小叶黑柴胡多糖（BPs）可增强巨噬细胞免疫功能，能抑制脂多糖诱导的炎症介质分泌［29］。WU 等研究表明，小叶黑柴胡多糖能抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子（TNF-α， IL-6， IL-1β， IL-12p40，and IFN-β）和NO 释放的增加，通过调节TRL4 受体信号从而减弱脂多糖诱导的炎症反应［30］。CHENG 等研究发现，小叶黑柴胡多糖粗提物能减轻“两次打击”所致的大鼠急性肺损伤［31］。用小叶黑柴胡多糖粗提物不同剂量灌胃给药，能减少补体C3c 在肺部的积蓄而改善病理损伤，且能使大鼠支气管肺泡灌洗液内蛋白质浓度、白细胞计数、肺髓过氧物酶显著减少，还能介导肺泡灌洗液和血清中的白介素6 和肿瘤坏死因子α 减少；此外还能降低总的补体溶血活性。小叶黑柴胡多糖对炎性疾病的作用机制可能与其对炎性介质产物的增加和补体过度激活的抑制作用有关。王铮等检测了小叶黑柴胡总多糖对绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应的影响，测定小鼠T、B 淋巴细胞转化功能；检测药物对小鼠血清溶血素水平的影响；中性红比色法测定小鼠腹腔巨噬细胞胞饮功能，硝酸还原酶法测定巨噬细胞培养上清液中一氧化氮水平。结果表明，浓度为40 mg/kg 时小叶黑柴胡总多糖显著抑制迟发型变态反应，20 mg/kg 时显著增强腹腔巨噬细胞胞饮能力，显著升高血清溶血素水平。小叶黑柴胡总多糖刺激淋巴细胞增殖，并协同刀豆球蛋白A 促进小鼠T 淋巴细胞增殖［32］。CHENG等的研究表明，小叶黑柴胡多糖能增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能（对凋亡胸腺细胞的吞噬作用），抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）和NO 释放［33］。郭立等研究了小叶黑柴胡根粗提物对补体系统的作用。在经典激活途径中，小叶黑柴胡根粗提物与补体预先混合，能降低体系最终的溶血，而与溶血素或羊红细胞预先混合，体系的溶血无明显改变。在旁路激活途径中小叶黑柴胡根粗提物与补体预先混合也能降低体系最终的溶血，而与兔红细胞预先混合，体系的溶血无明显改变［34］。赵玉珍等研究证明，乙醚提取物还能使小鼠胸腺增重，使小鼠血清IgG含量升高，有显著增强机体免疫功能的作用，而相同剂量的北柴胡对小鼠胸腺和血清IgG 含量无显著影响［28］。

4.3 保肝

罗磊等通过代谢物组学方法，对小叶黑柴胡总黄酮防治α- 萘异硫氰酸酯（α-naphthylisothiocyanate，ANIT）所致大鼠急性黄疸型肝损伤过程中的尿液代谢组进行研究，结果显示，给药组和模型组相比，大鼠尿液代谢物中马尿酸、庚酰肉毒碱、5β- 胆甾烷-3α，7α，12α，23R，25- 醇、4- 羟双氢鞘氨醇、二氢神经鞘氨醇、溶血磷脂酰乙醇胺、苯乙尿酸等含量降低，6- 酮前列腺素F1α 和3- 磺基去氧胆酸含量升高，提示小叶黑柴胡总黄酮明显缓解α- 萘异硫氰酸酯引起的大鼠急性黄疸型肝损伤，可用于防治急性黄疸型肝损伤［35］。刘秀芳等用碳粒廓清法比较正常组与小叶黑柴胡茎叶总黄酮给药组的碳粒廓清指数，与正常组相比，小叶黑柴胡茎叶总黄酮给药组能提高廓清指数K 值和校正廓清指数α 值；能降低小鼠免疫肝损伤模型的ALT 和AST 活力和肝组织中MDA 的含量；能明显改善肝组织的病理学改变［36］。詹雪晶等观察小叶黑柴胡茎叶总黄酮对大鼠肝内胆汁淤积时血清、肝组织指标变化的影响，并与尤思弗胶囊作对照。结果与模型组相比，经小叶黑柴胡茎叶总黄酮预防性治疗后，胆汁淤积大鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、谷酰胺转肽酶（GGT）的活力明显降低，肝组织Na+，K+-ATP 酶活性明显提高，小叶黑柴胡茎叶总黄酮能明显提高胆汁淤积大鼠的胆汁流量；小叶黑柴胡茎叶总黄酮高剂量在利胆、提高肝组织Na+，K+-ATP 酶活性、降低血清TBIL、ALP 活力方面优于尤思弗胶囊组［37］。詹雪晶等考察了小叶黑柴胡茎叶总黄酮（TFA）对四氯化碳（CCl4）所致小鼠急性肝损伤的保护作用。与CCl4模型组相比较，经TFA 预防性治疗后，小鼠血清中ALT、AST 的活性明显降低，同时肝组织中MDA 的含量明显下降、SOD 的活力明显增强。形态学观察显示，小叶黑柴胡茎叶总黄酮能明显改变肝组织的病理变化［38］。

4.4 抗氧化

刘秀芳等采用分光光度法，测定小叶黑柴胡茎叶总黄酮对DPPH 自由基、OH 自由基和O2-自由基的抑制效果，考察小叶黑柴胡茎叶总黄酮的体外抗氧化能力。小叶黑柴胡茎叶总黄酮对DPPH自由基活性、OH 自由基和O2-自由基的清除率可达94.67%、93.60%和90.04%［39］。

4.5 抗肿瘤

胡淑婷等研究了小叶黑柴胡诱导人胃腺癌MGC-803 细胞的凋亡效应。将MGC-803 细胞培养于基础培养基中，加小叶黑柴胡的乙醚提取物，计算细胞死亡率、细胞生长抑制率、克隆形成率，并观察形态学变化，应用凝胶电泳、激光扫描共聚焦显微镜观察分析小叶黑柴胡作用MGC-803 细胞后的细胞DNA 含量的改变。结果表明，小叶黑柴胡乙醚提取物作用后细胞死亡率、细胞生长抑制率升高，克隆形成率降低，细胞DNA 含量减少［40］。吴克勤考察了柴胡皂苷D 体内抑瘤的最佳剂量及柴胡皂苷D 与奥沙利铂联合用药对肿瘤的生长状态的影响。用TUNEL 法检测凋亡细胞，ELISA 法检测血清中前列腺素E2（PGE2）浓度变化，Western blot 检测瘤体中COX-2 蛋白的表达。柴胡皂苷D 在1.0 mg/kg 时抑制作用最佳（抑瘤率40.96%），柴胡皂苷D 与奥沙利铂联合用药诱导荷瘤裸鼠瘤体凋亡的作用强于二者单独用药；单独和联合用药PGE2 浓度、COX-2 表达量均显著降低，且联合用药组的PGE2 浓度和COX-2 表达均显著低于单用组。表明柴胡皂苷D 联合奥沙利铂用药能产生协同作用，其抑瘤作用可能是通过下调COX-2 蛋白的表达来实现［41］。

4.6 药物相互作用

高柳柳等研究了柴胡提取物与氯苯那敏在大鼠体内药物间的相互作用，表明柴胡提取物能够降低大鼠体内氯苯那敏的代谢清除率，临床上用药时应尽量避免两种药物的联合使用［42］。

5 展望

小叶黑柴胡作为柴胡在甘肃、青海、宁夏等的地方习用品，有较长的用药历史，已载入地方中药标准，且未见有中毒的临床报告。但有文献提到小叶黑柴胡有毒［43-44］，经过查阅其所引用文献［27］，小叶黑柴胡乙醚提取物小鼠灌胃LD50为（10.25±1.33）g/kg，按毒性物质危险等级为一级“实际无毒性”，折合原生药192.35 g/kg，为零级“无毒”。但为确保用药安全，应该对其毒性进行研究验证［45］。小叶黑柴胡的部分化学成分与大叶柴胡相同，这些成分在北柴胡中都未检测到，而且其中不含柴胡毒素、乙酰柴胡毒素等毒性成分［46］，提示小叶黑柴胡相对北柴胡可能具有某些特殊的药理活性，且又没有大叶柴胡的毒性，初步研究已发现其抗肿瘤作用，应对此进行深入研究。目前小叶黑柴胡药材全部为野生采集，人工栽培及研究工作鲜见报道，为保护环境，使其资源能永续利用，应加强其人工栽培方面的研究工作。小叶黑柴胡的有效成分主要在根部的韧皮部中［47］，支根多则韧皮部在药材中所占比例增大，有效成分含量提高，因此在品种选育时可据此性状结合其他指标选出优良品种。

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