酸性α－淀粉酶研究进展

张玉然 张晓云 田 田 杨胜超

（济宁医学院生物科学学院，山东 日照276862）

α－淀粉酶（1，4－α－D－葡聚糖水解酶），又称液化酶，根据酶学性质的不同，可分为酸性α－淀粉酶、碱性α－淀粉酶、耐热性α－淀粉酶和耐盐性α－淀粉酶［1］。酸性α－淀粉酶因其可在低pH值条件下保持高活性迅速水解淀粉而得名，它可随机切断淀粉分子内的α－1，4糖苷键，将其降解为糊精、寡糖、麦芽糖等小分子，使淀粉黏度下降，酸性α－淀粉酶具有广阔的应用潜力和开发前景［2－3］。

1 酸性α－淀粉酶的开发价值及应用

淀粉质原料的水解制糖工艺，涉及液化和糖化两阶段，所使用的酶分别为α－淀粉酶（液化酶）和糖化酶［4］。α－淀粉酶的最适反应pH 多为5．8～6．2，糖化酶的最适反应pH 则为4．0～5．0［5－6］，这致使淀粉质原料液化后进入糖化前需加入大量酸试剂调低pH值，因此，开发酸性α－淀粉酶，使其最适反应pH与糖化酶相近，可节省大量酸试剂的消耗，节约成本。

在固态发酵行业，如酿酒、食醋酿造，微生物的生长繁殖促使发酵pH值偏酸性，而在酸性pH条件下，常用中高温及碱性α－淀粉酶酶活性明显降低，这导致淀粉质原料利用不彻底。因此，开发耐酸性的α－淀粉酶，提高发酵过程中淀粉质原料的利用率，可大幅降低生产成本，提高生产率。

据报道，酸性α－淀粉酶已广泛应用于食品加工、酿酒、制糖、纺织、饲料生产、造纸等行业［7－11］，该酶占据了酶制剂市场约25%的份额，开发耐酸性α－淀粉酶具有良好的经济和社会效益。

2 酸性α－淀粉酶的来源

酸性α－淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中，目前工业上应用的酸性α－淀粉酶多为微生物来源。已报道的可产酸性α－淀粉酶的微生物有黑曲霉（Aspergillus niger）［12－13］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［2，14］、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）［15］、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）［16］、酒 香 酵 母 菌 （Brettanomyces）［17］、解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 （Bacillus amyloliquefaciens）［18］、嗜 热 真 菌 （Thermomyces lanuginosus）［19］、酸居芽孢杆菌（Bacillus acidicola）［20－21］、玫瑰暗黄链霉菌（Streptomyces roseofulvus）［22］、小孢 根 霉 （Rhizopus microsporus）［23］、桔 青 霉 菌（Penicillium citrinum）［24］、嗜酸酸居芽孢杆菌（Acidophilic Bacillus acidicola）［25］、白曲霉（Aspergillus kawachii）［26－27］等。工业上生产酸性α－淀粉酶的菌株则主要为黑曲霉和枯草芽孢杆菌［1，4］，这主要是由于二者发酵周期短，易于操作，所产酸性α－淀粉酶的耐酸性强，发酵酶活力高。

3 酸性α－淀粉酶高产菌株的选育

自然界中可产酸性α－淀粉酶的微生物众多，但各菌株产量有差异，为提高生产率，满足工业生产需求，需利用特定的筛选培养基，从自然界中分离出酸性α－淀粉酶高产菌株。研究者利用筛选的野生菌株，通过诱变育种、基因工程育种等技术进一步选育高产酸性α－淀粉酶的优良菌株。目前，应用于酸性α－淀粉酶高产菌株筛选的方法有紫外线诱变育种［28］、紫外－硫酸二乙酯（DES）复合诱变育种［29］、原生质体诱变育种［30－31］、氮离子束诱变育种［32］、基因工程育种［33－38］等。

紫外线诱变具有设备简单、操作方便的优点，是目前微生物育种中最常用的诱变方法。游玟娟等［28］利用30W紫外灯于30cm处照射枯草芽孢杆菌BF7658，利用变色圈法结合摇瓶复筛获得一株高产突变株，酶活达3418．8U／mL，比出发菌株提高了59．7%。紫外－硫酸二乙酯复合诱变是联合使用物理和化学诱变处理的方法，钱萍等［29］利用该法诱变黑曲霉（ATCC－1602），利用透明圈法获得一株高产突变株，酶活最高达394．1U／g，较原始菌株提高了10倍。

原生质体诱变育种是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，而后从再生培养基中筛选出高产突变株的技术。相比于传统诱变育种，该方法诱变效率高，操作简便，但周期比传统诱变育种长［31］。目前，应用原生质体诱变育种选育高产酸性α－淀粉酶菌株的报道较少。黄伟等［30］利用紫外线诱变处理黑曲霉0－2－1孢子原生质体，结合透明圈法筛选出了高产酸性α－淀粉酶的突变株，与出发菌株相比，高产突变株产酶活力提高了54．9%（184．7U／mL），且遗传稳定性良好。

氮离子束诱变育种是近年来发展起来的一种诱变方法，由于离子注入具有能量沉积、动量传递、电荷交换等多重效应，氮离子束诱变的效果更为理想。戚薇等［32］将低能（30keV）氮离子注入枯草芽孢杆菌BF7658中，诱变筛选获得一株高产选型α－淀粉酶的突变株，酶活力达343U／mL。

基因工程育种是在分子水平上对菌株进行改造，根据人为设计，使目的基因在工程菌内大量异源表达。该育种技术可定向设计，具有极强的目的性，周期短，效率高，是育种技术中最为高效的方法。来自芽孢杆菌酸性α－淀粉酶基因的异源表达研究最多，其表达宿主菌主要有枯草芽孢杆菌［33］、大肠杆菌［34，38］等。除芽孢杆菌外，魏涛等［36］报道了超嗜热古菌高温酸性α－淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达；Zeng等［37］报道了黑曲霉酸性α－淀粉酶基因在毕赤酵母中的异源表达，酶活达2838 U／L，高于已报道的芽孢杆菌和超嗜热古菌酸性α－淀粉酶的异源表达量。

4 酸性α－淀粉酶发酵条件优化

发酵条件优化是增强微生物生长及产酶的重要手段，可优化的发酵参数主要有培养基组成、温度、溶解氧、湿度、pH值等。目前，研究者已对固态发酵［10，39］和 液 态 发 酵［2，21，26－27］合 成 酸 性 α－淀 粉 酶的条件进行了优化，所涉及的产酶菌株主要有黑曲霉、枯草芽孢杆菌、小孢根霉、副干酪乳菌、酵母菌等。固态发酵方面，Sharma等［39］以酸居芽胞杆菌为菌株，通过响应面法优化了湿度、淀粉和硫酸铵3因素，最终使酸性α－淀粉酶产量达28U／g。液态发酵方面，Masuda等［27］利用白曲霉发酵生产酸性α－淀粉酶，通过控制无硬壳淀粉质原料中葡萄糖的释放量，使酸性α－淀粉酶的酶活力达51U／ml；王建玲等［2］则利用筛选获得的枯草芽孢杆菌，经发酵条件优化使该酶酶活力达221U／ml。

5 展望

酸性α－淀粉酶由于其耐酸特性，可在低pH下高效率催化淀粉质原料的水解液化，该酶的开发利用，可提高酸性条件下淀粉质原料的利用率，节省成本。目前对酸性α－淀粉酶的研究已取得大幅进步，但仍存在待改进事宜。诱变育种方面，目前仅采用紫外线诱变、紫外－硫酸二乙酯复合诱变、原生质体诱变及氮离子束诱变对产酶菌株进行诱变筛选，后续可引入其他化学诱变剂诱变或使用近年来兴起的常压室温等离子体诱变（ARTP）进行筛选高产菌株。基因工程育种方面，高产酸性α－淀粉酶工程菌的构建仍存在不足，酶产量偏低，诱导方式复杂，难于规模工业化生产，研究者应进一步探寻酸性α－淀粉酶耐酸的机理及相关基因的调控，优化诱导方式。发酵条件优化控制方面，研究者仅对摇瓶发酵水平上的产酶条件进行了优化，后续可对发酵参数进行过程控制。如固态发酵时，可针对湿度、温度等关键参数，设计便于固态发酵控制的反应器，在反应器中进行控制。液态发酵时，则可选取合适的发酵罐，对温度、pH值、溶解氧等关键参数进行控制，结合发酵动力学参数变化，探寻最适于酸性α－淀粉酶生产的发酵条件。

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