利多卡因后处理对家兔心肌缺血-再灌注损伤TNF-α NF-κB表达的影响*

王 友 朱苏红 王建礼 林 娜 王保生

(济宁医学院基础学院，山东 济宁，272067)

利多卡因后处理对家兔心肌缺血-再灌注损伤TNF-α NF-κB表达的影响*

王 友 朱苏红 王建礼 林 娜 王保生

(济宁医学院基础学院，山东 济宁，272067)

目的 研究家兔心肌缺血-再灌注损伤时，利多卡因后处理对其体内TNF-α水平及NF-κB表达的影响。方法 18只家兔随机分为假手术组、缺血-再灌注组和利多卡因组3组。结扎家兔心脏的左室支40min后解除结扎，恢复血液供应，再灌注2h后测定各组家兔血浆TNF-α的水平，通过免疫组化染色和免疫印迹方法观察心肌NF-κB的表达情况。结果 与缺血-再灌注组比较，利多卡因组再灌注后血浆TNF-α浓度明显降低，心肌细胞NF-κB的表达显著减少。结论 利多卡因可以抑制再灌注心肌炎症反应，减轻损伤。

利多卡因；后处理；心肌缺血-再灌注损伤；NF-κB；TNF-α

在我国，缺血性心脏病已成为死亡的首要原因，在缺血性心脏病的防治中，经皮腔内冠状动脉成形术、心脏动脉搭桥术及心脏移植等治疗技术广泛的开展使缺血性心脏病得到了有效的防治，可是术后心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的发病率在逐年增高，减轻MIRI已成为缺血性心脏病治疗的重要环节。本文旨在探讨在体情况下，利多卡因后处理对家兔心肌缺血-再灌注时炎性损伤的抑制作用，进而减轻MIRI，为临床MIRI的防治提供新的手段。

1 材料和方法

1.1 材料

实验选用健康的新西兰白兔(本校实验动物中心提供)18只，雄性，体重2.5～3.0kg；家兔TNF-α ELISA检测试剂盒(R&D 美国)；NF-kB抗体(武汉博士德)；全自动酶标分析仪(MK3 Thermo，美国)。

1.2 动物的分组及处理

将18只家兔随机分成缺血-再灌注组(IR组)、利多卡因组(L组)和假手术组(sham 组)。各组处理方式如下：1) IR组：家兔全身麻醉后，于颈部甲状软骨至胸骨上行正中切口，分离气管后行气管插管术连接动物呼吸机(30ml，45次/min)；家兔四肢皮下插入针性电极，实时监测心电图(Ⅱ导联)；沿家兔胸骨左缘处纵行切开皮肤(2～5肋)，将肌肉逐层结扎切开分离，暴露肋软骨，仔细分离肋间肌肉，暴露第3、4肋骨，剪断肋骨暴露胸腔。小心剪开心包，暴露心脏，以左心耳到心尖连线的中点为结扎点，使用带线缝合针(6-0)结扎左室支，其上放置一段硅胶管(长15mm，直径5mm)，结扎硅胶管，阻断左室支血流，以心电图示ST段明显上抬，作为左室支结扎成功、心肌发生缺血的标准。心肌缺血40 min后，耳缘静脉注射生理盐水(0.5ml/kg)后剪去结扎线，以心电图ST段回落，表明心肌灌注恢复，再灌注120 min后终止实验。2)L组：手术处理与IR组相同，再灌注前耳缘静脉注射利多卡因(5mg/kg，10mg/ml)，再灌注120min终止实验；3)sham组：手术处理与IR组相同，但只穿线，不结扎，于40min时耳缘静脉注射生理盐水(0.5ml/kg)，120min后终止实验。

1.3 血浆中TNF-α水平测定

各组家兔再灌注120min后，于颈总动脉放血2ml，置于离心管中，离心15min(3000r/min，4℃)后取上清，置于-20℃冻存备用。使用家兔TNF-αELISA检测试剂盒检测血浆TNF-α水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 心肌组织中NF-κB的检测

各组家兔再灌注120min后，从左室支结扎点以下横切留取心肌标本，厚度约为0.4cm，置于4%多聚甲醛溶液固定；留取心尖组织约1g，-80℃冻存备用。固定的心肌组织标本进行石蜡包埋，制成约5μm厚切片行免疫组织化学染色。留取的心尖组织剪碎，加入蛋白裂解液，使用匀浆机匀浆，冰上静置30min，离心30min(12000g，4℃),取上清。BCA法测定蛋白质浓度，取80μg进行SDS-PAGE (10%)电泳，Western blot分析NF-κB的表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行统计分析。

2 结果

2.1 各组家兔血浆TNF-α的水平比较

再灌注120min后，sham组、IR组、L组家兔血浆TNF-α水平分别为(68.2±5.1)、(95.3±9)、(80.3±2.4)，后两组TNF-α水平明显高于sham组(P<0.05)，且IR组血浆TNF-α水平高于L组(P<0.05)。(见图1)。

与假手术组比较* P<0.01；与缺血-再灌注组比较# P<0.01

2.2 家兔心肌组织中NF-κB的表达

免疫组化染色可见，sham组(图2A)家兔心肌细胞排列正常，无水肿、出血等，除血管内皮细胞有微弱NF-κB表达，其余部位基本不表达。IR组(图2B)心肌细胞断裂明显，有大量的单核细胞浸润，损伤严重，细胞内NF-κB呈强阳性(棕黄色)表达。L组(图2C)心肌细胞损伤较轻，细胞内阳性表达较弱。Western blot检测，以GAPDH校准后蛋白条带的IOD值表示心肌组织NF-κB表达的变化。与sham组NF-κB表达量(0.45±0.018)相比，IR组(0.73±0.015)和L组(0.5±0.023)NF-κB表达分别增加61%，13%，与IR组比较，L组表达低29%。见图3。

A：假手术组；B：缺血-再灌注组；C：利多卡因组

图2 利多卡因后处理对心肌缺血-再灌注家兔心肌组织NF-κB(p50)表达的影响(HE×400)

与假手术组比较*P<0.01；与缺血-再灌注组比较#P<0.01

3 讨论

MIRI临床主要表现为心肌舒缩功能降低、心律失常及心肌顿抑等，如何有效的改善MIRI已成为临床上治疗缺血性心肌病的重要课题。1986年，Murry[1]首次提出了缺血预处理的概念，即缺血前，反复几次的短暂的“缺血￣再灌注”循环处理可以减轻缺血-再灌注损伤，但是缺血预处理在临床上的可操作性不强。2003年，Zhao[2]等发现缺血后处理的方法可有效减轻缺血-再灌注损伤，这为临床上防治缺血-再灌注损伤提供了更具操作性的措施，现已证实缺血后处理和多种药物后处理的方法均可有效减轻缺血-再灌注损伤。心肌缺血-再灌注时，血管内皮细胞、白细胞等被激活，生成、释放大量的炎性因子，介导组织细胞的炎性损伤是MIRI的主要发生机制。TNF-α是体内重要的炎性因子，可以刺激中性粒细胞激活，促进血管内皮细胞表达黏附分子，使中性粒细胞在缺血心肌组织中聚集，释放蛋白水解酶和活性氧等物质，加重心肌组织损伤[3]。本文结果显示，MIRI时，机体血浆中TNF-α的表达明显增加，利多卡因后处理可明显的减少TNF-α的表达，减轻炎性损伤。

NF-κB参与MIRI的病理生理过程，NF-κB活化后移位入核可能是急性炎症发生发展的最早启动的关键环节。NF-κB活化会促进多种炎症介质、黏附分子如ICAM-1等基因的表达[4]。本文结果显示缺血-再灌注组和利多卡因组心肌细胞在缺血再灌注时，NF-κB表达均增加，且与TNF-α的表达呈正相关，表明利多卡因后处理可使心肌NF-κB的表达减少，进而减少炎症因子TNF-α的表达，减轻MIRI。

利多卡因在临床上多作为局麻药和抗心律失常药使用，近年来研究发现，利多卡因对多种炎性因子有抑制作用，且已在各种疾病模型中得到证实，其抗炎作用甚至超过了传统的非甾体类抗炎药[5]。本实验前期研究表明，利多卡因可以有效地减轻家兔心肌缺血-再灌注后的炎性损伤[6]，本文结果显示利多卡因后处理可减少心肌细胞NF-κB的表达及炎性介质TNF-α的表达，减轻心肌炎性损伤，对于缺血-再灌注心脏有一定的保护作用。

[1] Murry C E,Jennings R B,Reimer K A， et al.Preconditioning with ischemia:A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986，74(5):1124-1136.

[2] Zhao Z Q,Corvem J S,Halkos M E,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic post-conditioning during reperfusion:comparison with ischemic pre-conditioning[J].Am J Physiol 2003,285(2):579-588.

[3] Balkwill F,Joffroy C.TNF:a tumor-suppressing factor or a tumor-promoting factor?[J].Future Oncol，2010,6(12):1833-1836.

[4] Nichols T C.NF-kappaB and reperfusion injury[J].Drug News Perspect，2004，17(2):99-104.

[5] Azuma Y,Shinohara M,Wang P L,et al.Comparison of inhibitory effects of local anesthetics on immune functions of neutrophils[J].Int J Immunopharmacol,2000，22(10):789-796.

[6] 王友,王保生,林丽文，等.利多卡因减轻家兔心肌缺血-再灌注炎性损伤的研究[J].济宁医学院学报,2012,35(2):100-103.

The effect of lidocaine post-treatment on TNF-α and NF-κB in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury

WANGYou,ZHUSuhong,WANGJianli,LINNa,WANGBaosheng

(School of Basic Sciences,Jining Medical University,Jining 272067,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of lidocaine post-treatment on TNF-α and NF-κB in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury.MethodsEighteen rabbits were randomly divided into 3 groups，sham operation group,ischemic reperfusion group and lidocaine group.The left ventricular branch (LVB) of rabbits was ligated for 40minutes,then the ligation was removed.Afer 120 minutes the level of plasma TNF-α was measured,meanwhile the degree of NF-κB was detected with immumohistochemical staining and Western blot.ResultsCompared with those of ischemic reperfusion group,the concentration of TNF-αwas decreased in lidocaine group (P<0.01).The expression of NF-κB was inhibited by lidocaine too.ConclusionThe results demonstrated that lidocaine could protect cardiac function,inhibit inflammatory response and attenuate reperfusion injury in ischemic heart.

Lidocaine；Post-treatment；Myocardial ischemia reperfusion;NF-κB；TNF-α

* [基金项目]2008年济宁医学院青年基金资助项目

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.05.004

R363.2

A

1000-9760(2015)10-318-03

2015-08-17)