尿液中检测循环miRNA的研究进展

易浔飞 综述，钟秋蓉 审校(南京军区福州总医院全军临床检验医学研究所，福州 350025)



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尿液中检测循环miRNA的研究进展

易浔飞 综述，钟秋蓉 审校(南京军区福州总医院全军临床检验医学研究所，福州 350025)

miRNA； 尿液； 生物标志物

1 尿液循环miRNA检测的研究基础

人体内估计超过1/3的细胞转录组受miRNA调节，虽然数目相对不多(少于2 000种)，但在常见的组织和体液中miRNA有很高的稳定性，miRNA表达增殖的潜力可准确辅助定量分析与分散的组织类型和疾病状态有定位关系的miRNA，从而作为一个诊断新工具。

有研究认为外泌体是转运miRNA的细胞结构基础，外泌体是纳米级别的细胞单层膜结构，可由机体多种类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汗、尿液等体液中。外泌体可携带多种mRNA、miRNA、蛋白质，参与细胞间通讯，重启免疫系统，血管新生、肿瘤细胞生长等过程。在肿瘤或疾病中，这些分子都可以作为生物标志物[1]。miRNA也是重要的调节分子，涉及细胞生长全过程，如时序发育、干细胞分化和凋亡，可作为一种“肿瘤信号”[2]。

研究显示miRNA在病理发展中会快速从组织中释放入血，在血清、血浆、唾液和尿液中，这些胞外miRNA与肿瘤的不同病理状态有关。Weber等[3]检测了12种来自于不同阶段怀孕妇女和不同泌尿道上皮细胞肿瘤患者的体液和尿液标本中的miRNA，应用定量PCR对这些体液中的miRNA做广谱分析。结果显示miRNA在所有体液中均存在，在不同体液中构成比明显不同，一些高水平的miRNA在多种体液中表达相同，而一些miRNA在特定体液中富集，还观察到不同生理状态的尿液标本具有独特的miRNA模式。提示使用特定miRNA水平可用作检测和监测不同病理生理学状态。

细胞坏死和凋亡过程产生的miRNA片段会大量释放到尿液中，且尿液在临床上容易大量获得，所含蛋白也比血液标本少，所以RNA预处理和后续检测时蛋白干扰也较低。19～25个核苷酸长度的miRNA可对抗核酶的降解而更加稳定，敏感性和特异性上都优于现有标志物[4]。

2 尿液循环miRNA与泌尿系统肿瘤

miRNA已经证实与一些肿瘤细胞增殖有关，出现一类新级别的癌基因或是抑癌基因时多表现为异常表达。通过检测miRNA可确定肿瘤的分化程度，特别是对低分化肿瘤分期的准确性高于以往的mRNA分期[5]。

目前膀胱癌的诊断“金标准”是膀胱镜检，但具有一定损伤和相对昂贵，而普通的尿液镜检对低分化膀胱癌的敏感性较差。Yamada等[6]结合miR-96、miR-183与尿液镜检对膀胱癌患者标本进行了队列研究，除发现miRNA上调，两者联合检测从78例膀胱癌中诊断出61例，敏感性从43.9%提升到78.2%。还发现miR-96 和miR-183 表达量增加与肿瘤进展级别和病理分期同步，在术后尿液中两者表达水平降低，提示这两种miRNA可作为膀胱癌的标志物，miR-96结合尿液镜检也可成为一个很好的诊断指标。另外应用数学预测模型优化尿液miRNA的结果分析也显示了比镜检显著改进的诊断正确度[2]。另外常规保存的尿液细胞涂片也能用于miRNA表达谱分析，Simonato等[7]使用qRT-PCR在常规尿液细胞涂片中分析miR-145、miR-20所选的涂片标本均可抽提到满意的总RNA，而20 ng总RNA就可用于miRNA表达谱分析。结果提示，膀胱癌患者标本中的miR-145、miR-205显著下调。

检测尿液中RNA类的肿瘤标志物还可以用于诊断其他泌尿系统的实体肿瘤，而且这类循环miRNA的独特表达模式与特定的疾病相关，特别是早期阶段，其高特异性和敏感性的潜能可用于肿瘤分期和早期预测[8]。Bryant等[9]使用含有742个miRNA的Exiqon qRT-PCR芯片分析了78例前列腺癌患者和28例健康对照血清标本，确定了12个表达量差异的miRNA。进而检测135份健康人与前列癌患者尿液标本中5个选定的miRNA，发现肿瘤患者尿液中miR-107和miR-574-3p水平显著高于健康对照，均可诊断出前列腺癌患者，并且准确性高于检测尿液前列腺特异性抗原(PSA)。Hanke等[10]建立了一种对尿液标本中小相对分子质量的RNA进行预处理和分子检测技术，用于非侵入性的诊断泌尿道上皮膀胱癌。提取了来源于膀胱癌患者(低分化组和高分化组)和健康志愿者尿液标本中的小相对分子质量RNA，使用定量RT-PCR检测了157种miRNA，发现利用miRNA-126/miRNA-152的比值来诊断膀胱癌的特异性为82%，敏感性为72%，ROC曲线下面积为0.768(95%CI：0.605～0.931)，具有相当高的准确性。

尽管在尿液中无创检测RNA肿瘤标志物的优点很多，但是尿液中不仅含有肿瘤细胞，也有凋亡和坏死细胞，如良性剥落的泌尿道上皮细胞、白细胞，还有非细胞来源的RNA，都可能干扰RNA的检测。早期研究中，在尿液中检测组织来源的标志物的诊断性能弱于直接检测实体肿瘤。Hanke等[11]研究了新方法来减少尿液标本的影响因素，可最小化检测误差。通过在尿细胞颗粒,细胞降解碎片和尿液中分别提取RNA，用qRT-PCR定量检测。使用1个外部RNA标准品标准化每一个步骤，来平衡尿液标本中背景因素的干扰。比较了尿液标本中4个预设的RNA肿瘤标志物和5个已确认的组织来源RNA组织标志物的表达情况，结果表明ETS2 mRNA/uPA mRNA 的比值用于诊断膀胱癌的特异性为100%，敏感性为75.4%，ROC曲线下面积为0.929(95%CI：0.882～0.976),可作为一种潜在的膀胱癌诊断标志物。

3.2 颗粒粒度测定方法 本研究采用BT-9300H型激光粒度分布仪分析系统对颗粒进行粒度测定，利用测定激光束穿透颗粒混悬液的散射估计出颗粒的平均体积，如假设颗粒为标准球体，则可计算出颗粒直径。和传统光镜或电镜测量方法相比，具有快速，误差小，精确度高，操作简便，可定量分析的优势，尤其适用于大样本的测定。激光粒度分析仪的不足之处在于：忽略了颗粒的形状，可能会对颗粒的计算结果产生一定的影响。

检测尿液miRNA还可用于泌尿系统肿瘤的病理机制研究，Shimizu等[12]使用芯片评估了肿瘤细胞株、原癌组织、术前和术后尿液标本中miRNA基因甲基化。提示膀胱癌细胞中沉默后miRNA的异位表达可以抑制其生长和侵袭性，提示miRNA基因的后天沉默可能与肿瘤进展有关，且miRNA基因的甲基化可作为肿瘤检测的生物标志物。

3 尿液循环miRNA与肾脏疾病

体内的外泌体和胞外液囊的循环水平可影响肾病的进展。液囊可作为细胞通讯的胞外载体，运输功能性分子(如mRNA、miRNA等)到受体细胞。外泌体和外泌体介导的信号转导可在疾病发生中起效，如动脉粥样硬化、肾病，成为诊断和治疗肾病的潜在标志物[13]。在与之相关的miRNA与肾病的相关研究中，发现其表达差异出现于肾与其他器官、或是肾脏不同部位。而且miRNA还在足突状细胞的生长中起重要作用，如糖尿病肾病、多囊性肾病。尤其注意的是，在小鼠模型中发现足突细胞缺失特有的Dicer(miRNA起源中的1个关键酶)，可导致蛋白尿和严重肾损伤。

肾活检是肾脏疾病诊断的金标准，但需入院操作，且有3%并发症的风险，定量检测尿液miRNA提供了慢性肾病标志物的一个可选途径[14]。Wang等[15]分析了IgA肾病患者尿沉渣标本中的miRNA表达，发现尿液中miR-200a、miR-200b和miR-429的表达量下降，与尿蛋白阳性相关。说明其可用于评估IgA肾病，上调程度与肾病的临床与组织严重性相关[16]。Wang等[17]使用肾缺血再灌注老鼠和STZ诱导肾损伤老鼠作为急、慢性肾损伤模型，应用TaqMan探针的qRT-PCR方法评估鼠尿液、血清和肾组织中miRNA的变化。结果发现肾组织中富含的miRNA-10a(miR-10a)和miRNA-30d(miR-30d)很容易在尿液中检测到，且其水平与肾损伤的程度明确相关。相反这一变化并没在肾损伤后的鼠血清中发现。

目前常用的早期诊断肾损伤指标，如尿蛋白定量，预测价值有限。Wang等[17]使用小鼠的急慢性肾损伤模型，评估小鼠的尿液、血清和肾组织中miRNA的变化情况，结果显示肾富含的 miR-10a和miR-30d较易在鼠尿液中检测到，而且其水平与两种模型的肾损伤程度阳性相关，相反，肾损伤的小鼠血清中没有观察到相同的改变。提示尿液miR-10a和miR-30d用于检测肾损伤提供了一种非侵入、敏感、特异和潜在的高通量方法。Luo等[18]探讨了儿童先天性肾病综合征(NS)患者的血清、尿液miRNA作为标志物的临床价值，先用TaqMan低密度芯片筛查，再用定量RT-PCR确认血清标本中的表达差异miRNA，再收集患者尿液标本用于检测筛选出的miRNA。发现血清中5种miRNA水平和尿液中miR-30a-5p水平显著降低与临床治疗后病情改善相关。

糖尿病肾病机制研究发现高糖环境中miRNA(miR-192)可作为激活转化生长因子β的效应分子[19]。Argyropoulos等[20]观察了糖尿病肾病不同阶段患者尿液中的miRNA表达谱差异，miRNA表达谱覆盖了生长因子信号通路和已知糖尿病肾病肾纤维化通路。这些miRNA表达组合将可推断肾脏病时分子信号的改变，可用于糖尿病肾病的早期诊断、风险分级的标志物。

4 尿液循环miRNA与肾移植后的排斥监测

研究表明尿液细胞和外周血细胞中miRNA水平与急性肾移植排斥相关，可作为肾移植后急性排斥(简称急排)结局的预测因子。有研究应用这类非侵入性生物标志物的检测来预测肾移植后排斥，通过监测miRNA表达来预测肾移植后的状态，减少使用侵入性活检，预测急排的进展和肾移植后的慢性病变，提前使用保护移植肾功能的治疗方案，促进受者个性化的免疫抑制治疗[21]。Lorenzen等[22]评估了稳定期肾移植患者和急排期肾移植患者的尿液中miRNA，使用定量PCR方法检测了急排患者、无排斥移植患者、稳定移植患者伴泌尿系感染患者。急排患者相比健康对照发现miR-10b和miR-210下调，miR-10a上调，而急排患者相比稳定移植伴泌尿系感染患者仅miR-210有差别，移植一年后低miR-210水平患者可伴随出现GFR的降低。结果表明这些选定的miRNAs在急排患者的尿液中发生大幅改变，miR-210水平可确认肾移植急排的发生，并预测移植后的肾功能，可作为一个全新的急性肾排斥的生物标志物。

miRNA还参与了移植物免疫反应中引起移植器官的排斥作用，其基因特异转录沉默可以调节免疫反应的通路中如先天免疫的发展，炎性反应、T细胞、B细胞分化和移植物排斥的不同阶段，miRNA还在移植后综合征发展中起作用，如纤维化、肝硬化、致癌作用，常易引起移植器官的失败或不良结局，最近组织中定量检测miRNA的方法，以及在血清和尿液中检测的改进，可应用分析移植后如排斥、复发、肿瘤等[23]。因miRNA可在尿液中直接检测，所以可作为一种新的肾移植急排结局的预测因子。

5 尿液循环miRNA与心脏疾病

各种体液中(血清、血浆、唾液、尿液、母乳、眼泪)，大约90%的胞外miRNA都与蛋白结合(如Ago2、HDL和其他RNA结合蛋白)，约10%被小型膜表面分子包装(外泌体、凋亡小体)，因此这类胞外miRNA可介导细胞间通讯，最近的研究表明其水平和构成疾病、损伤状态有关，可成为心血管疾病的非侵入性生物标志物[24]。已有研究评估心肌梗死患者的血浆心肌特异miRNAs水平，同时在尿液标本中检测，探讨其与肌钙蛋白、心肌功能的相关性[25]。

研究显示尿液中miR-1是急性心肌梗死的标志物，小鼠试验中24 h即可有50倍的升高，而另一miR-208也仅能在心肌梗死后尿液中检出，并初步证实此类miRNA是经由相关外泌体转运而发挥功能[26]。Duan等[27]也观察了ST段升高的急性心肌梗死(ST-EMI)患者尿液中的心肌特异miRNA(miR-1)表达水平的改变，同时测定血清中cTnI、CK-MB的水平。结果心肌梗死患者血清cTnI、CK-MB和尿液miR-1均明显高于健康对照，且miR-1水平与CK-MB、cTnI 水平显著相关。

6 尿液循环miRNA与自身免疫性疾病

近期的研究显示miRNA在自身免疫性疾病的发病机制中起了重要作用，miRNA参与调节先天和获得性免疫反应，包括免疫细胞的分化和进展，如调节性T细胞稳定和功能化，这类调节miRNA的裂解能导致自身免疫性疾病。

Wang等[28]检测了系统性红斑狼疮(SLE)患者血液和尿液上清液中的miR-146a和miR-155，相比对照组，血清中miR-146a和miR-155降低，尿液中miR-146a水平增高，SLE患者的肾小球滤过率(GFR)与血清中miR-146a、miR-155(r=0.384,P=0.014)呈正相关。经钙三醇治疗6个月后，SLE患者血清miR-146a水平显著增加。后期又在SLE患者血清和尿液中检测了多种miRNA(miR-200系、miR-205和miR-192)水平，尿液中miR-200a、miR-200c、miR-141、miR-429和miR-192均低于对照组，SLE疾病活动指数(SLEDAI)与血清中miR-200a呈负相关，而尿液miRNA水平与其他临床参数没有显著的关系。说明尿液miRNA与血清中水平呈不同变化，两者间无关联性。多数尿沉渣中miRNA来自肾实质细胞产生，miRNA可参与SLE的病理过程，建议对其进一步研究[29]。

7 尿液循环miRNA检测技术的进展

尿液中含有的循环miRNA可用为一种生物标志物，用于早期诊断、预测临床结局和疗效监测，然而水平相对较低，为检测这些低水平的分子，必须在初始阶段对其进行特殊的富集。分析这类核酸基质的标志物目前多利用PCR或改良PCR，并与基因芯片等组合使用以提高敏感性和特异性[30]。

体液中特异miRNAs的存在模式提示其有希望成为替代标志物，但分析尿液中的miRNAs仍是一个挑战。难点包括从很有限的生物标本来源中恢复核苷酸、标准化策略、相关技术的性能验证等，现有大多数的研究仅引入较少患者队列限制了其有效性和实际应用。转录miRNA生物标志物成为临床常规诊断项目，还依赖于未来体液miRNAs能够实现快速、高效、标准化[5]。

为促进miRNA标志物的发现和临床应用，已出现一些新的技术平台。如基于基因组锁核酸(LNA)基础的miRNA-qPCR技术,具有很高的敏感性和稳定性，直接将重要临床来源的miRNA进行高通量复制，而不需提前扩增。通过上千份生物液体标本(血清、血浆、尿液)验证，应用质控系统，减少分析前和分析变量偏倚[31]。还有研究使用等速电泳来分离和敏感检测未标记分子(DNA、rRNA、miRNA)，简单操作就能百万倍预浓缩，再基于离子迁移率来有效分离和提取，可简单或不经预处理从复合物中抽提或纯化核苷酸，如细胞株、尿液、血液[32]。

还有研究将已知的胞外循环miRNAs编制成数据库：miRandola，使其成为生物医学研究的基本工具，这个miRNA数据库，允许用户推断循环miRNA的潜在生物学功能，以及与表型的联系，目前包含 2 132条记录，581个特异的常规miRNAs和21种类型标本[33]。

尿液中循环miRNA已成为一种新的非侵入性生物标志物，与多种疾病和组织损伤相关，已经涉及临床诊断的多个领域，如尿液miRNAs水平改变介入毒物诱导的肝损伤[34]、miRNAs成为兴奋剂(红细胞刺激剂)滥用的生物标志物[35]。可以预见随着检测技术的发展，尿液循环miRNA将成为临床诊断的一个新的强有力工具。

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