氨基糖苷类抗生素性耳聋基因治疗的研究进展

刘文杰，傅仲鹰

（吉林大学第一医院耳鼻咽喉－头颈外科，吉林 长春 130021）

自氨基糖苷类抗生素 （aminogloside antibiotics，AmAn）问世以来，氨基糖苷类抗生素性耳聋 （AmAn induced deafness，AAID）一直困扰着患者，其治疗局限于保护残余听力、药物 （非特异性药物）、高压氧、配戴助听器和人工耳蜗植入。AAID治疗最根本的目的是使损伤的毛细胞再生并且恢复其功能。研究［1－2］显示：基因治疗是AAID治疗的有效方法。同时有研究［3－4］显示：AmAn对毛细胞的损伤不同于机械性损伤，并且影响AAID基因治疗效果的因素错综复杂。本研究就AAID基因治疗的研究进展进行简要介绍。

1 AmAn和AAID

20世纪40年代，AmAn问世并应用于临床。AmAn的杀菌机制主要是药物结合在细菌的30S核糖体亚基阻碍氨基酸聚合从而干扰细菌的蛋白质合成导致细菌死亡［5］。AmAn因其特殊的抗菌作用和理化特性，目前在多重耐药结核、肺囊性纤维性病变、严重绿脓杆菌和假单胞菌感染、脑膜炎及复杂性院内获得性急性尿路感染等［6－8］仍然广泛应用。

AmAn应用于临床的同时，其耳毒性和肾毒性也引起人们的关注，临床应用受到限制。AmAn的耳毒性表现在能够使听觉毛细胞损伤，造成永久性的听力丧失。AmAn通过内吞或阳离子通道进入毛细胞［6］。AmAn经毛细胞内吞进入内质网和溶酶体，使溶酶体释放溶酶体酶或自身崩解，导致细胞死亡。AmAn可以结合Fe3＋，在细胞质中形成Fe2＋－AmAn复合物，这种氧化还原复合物能够产生活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS）［9］。线粒体受到 ROS破坏，释放细胞色素C（cytochrome C），激活一系列含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）［10］，包括caspase－3、caspase－8、caspase－9，其中caspase－8对细胞膜的细胞死亡因子受体刺激起反应［2］。caspase－9 激 活caspase－3，使ROS水平升高，然后激活丝氨酸蛋白酶（calpains）［11］。Calpain激活后可导致细胞骨架、膜蛋白、各种激酶和磷酸酶以及转录因子的彻底崩溃［4］。

2 AAID的基因治疗

2.1 AAID与毛细胞再生 20世纪80年代初，Corwin等［12］和 Cruz等［12－13］发现：非哺乳动物的毛细胞损伤后可再生。Bermingham 等［14］和 Brignull等［15］证实：成熟鸟类毛细胞损伤后再生的毛细胞能够恢复听觉和平衡功能。经过反复探索，20世纪90年代初，Forge等［1－2］发现：豚鼠毛细胞受AmAn损伤后，耳蜗中能够再生不成熟的毛细胞。

毛细胞再生的前体细胞来源多样，根据研究［1－2，12－15，21］可以归结为以下4个来源：①内耳感觉上皮中的干细胞；②支持细胞通过有丝分裂或直接分化为毛细胞；③受损区旁的毛细胞自我修复；④非感觉区上皮细胞迁移至受损区并分化为毛细胞。

2.2 AAID与线粒体基因突变 一部分AAID患者在应用小剂量或常规剂量的AmAn时出现 “一针致聋”的现象，其听力呈双耳对称性、重度感音神经性耳聋［16］。随着研究的深入，证实了 “一针致聋”的现象与线粒体基因突变有密切关联。

线粒体DNA （mitochondrial DNA，mtDNA）具有突变率高和母系遗传的特点，其中1555A＞G和1494C＞T是常见的引起母系遗传的非综合征型听力损失的突变位点，与AAID发生有密切关联。目前学者［17］认为：线粒体位于12SrRNA高度保守的解码区的同质性的A1555G和C1494T发生突变，在12SrRNA的高度保守的A位形成新的1494C－G1555或1494U－A1555碱基对，使得12SrRNA在二级结构上与细菌的16SrRNA的相应区域的二级结构更加相似。AmAn与其结合更加容易，因此，携带突变基因的人在接触了该AmAn时会更加容易出现或者加重耳聋。赵芳等［16］通过对AmAn易感的遗传性耳聋家系系谱分析进一步证实：mtDNA A1555G点突变是AAID遗传易感性的分子基础。研究［18］显示：mtDNAC1494T点突变的细胞株mtDNA编码蛋白合成减少，ATP产物减少，并且线粒体中ROS水平升高。庆大霉素作用于mtDNAC1494T点突变的细胞株系，更多功能障碍的线粒体发生融合和自噬。

目前发现线粒体的突变位点除1555A＞G和1494C＞T外，还有961insC、1095T＞C、961T＞G、1291T＞C和827A＞G都与药物性耳聋有关联［19］。

2.3 AAID和Atoh1基因 Atoh1基因即Math1基因，是现在应用最广泛及研究最深入的转录因子，属于碱性螺旋－环－螺旋转录因子 （basic helix－loop－helix，bHLH）家族，在多种组织中广泛表达。在内耳的发育过程中，虽然Atoh1在前体细胞中处于低转录水平，但对哺乳动物听觉毛细胞的生长发育是必需的。

Pan等［20］采用Pax2－Cre去掉小鼠胚胎时期内耳的Atoh1基因发现：出生后小鼠的柯蒂氏器会因缺乏Atoh1基因而致支持细胞数量减少、毛细胞未分化及输入和输出神经纤维大部分缺失，证明Atoh1在内耳发育及分化中的重要作用。近年来多项研究表明Atoh1能够使AAID损伤的毛细胞再生，并且恢复内耳的部分功能：Patrick等［21］采用携带Atoh1基因的腺病毒转染全聋的成年豚鼠的柯蒂氏器，3周后发现与未经治疗一侧比较毛细胞明显增多，听觉功能部分恢复。该研究结果表明：Atoh1基因治疗AAID可能通过残余毛细胞自身修复和促进支持细胞直接分化为毛细胞2种方式来增加毛细胞的数量。Lzumikawa等［22］过表达Atoh1基因治疗AmAn致聋的豚鼠，8周后不仅毛细胞再生，并且听力水平也得到提高。

2.4 AAID 和其他相关基因 Atoh1基因［21－22］在支持细胞中过表达能够促进支持细胞分化为毛细胞，而支持细胞不仅仅只表达 Atoh1基因，除 Atoh1外，Hes1、Hes5、MYC、Jagged2、Pax2和Sox2等都影响支持细胞的增殖和分化。

Hes1和Hes5基因负性调节Atoh1基因表达，从而阻碍支持细胞分化为毛细胞［23］。Du等［24］发现：出生3d的小鼠柯蒂氏器经AmAn作用毛细胞缺失，运用siRNA阻断Hes1或Hes5表达，支持细胞能够分化为毛细胞。MYC基因家族调节耳部发育，感觉细胞和非感觉细胞的合理分化，c－Myc基因能够使支持细胞重新进入有丝分裂［25］。Jagged2是Notch通路的配体，在听觉和前庭器官正常发育中起重要作用，去除Jagged2，支持细胞分化为毛细胞［26］。Pax2（Paired box 2）是Paired box基因家族的一员，在鸡和鼠听觉及前庭感觉原基及内淋巴管中表达，在内耳发育中起重要作用，Pax2基因融合可导致听觉及前庭器官缺陷。Chen等［27］发现：体外培养的新生小鼠柯蒂氏器，在新霉素作用24h后毛细胞缺失，使用腺病毒共表达Pax2和Math1基因转染柯蒂氏器上皮细胞，能够促进支持细胞在原先位置增殖、分化为毛细胞，并且获得一定的功能。Sox2是一种高迁移率家族转录因子，在保持细胞多能性及再生能力起关键作用，在哺乳动物听觉及前庭支持细胞内表达，可能与支持细胞细胞潜在的持续的自身更新及有丝分裂有关联［28］。

2.5 AAID和Notch信号通路 Notch信号通路［23］在内耳的发育中起关键作用，能够决定内耳感觉器官发育的部位，并且使毛细胞及其周围的支持细胞镶嵌分布，通过接触抑制控制两者的增殖和分化。毛细胞表达Notch配体Delta1和Jagged2，与相邻支持细胞的Notch受体相互作用，Notch蛋白通过3次剪切，释放NICD，使转录调节因子Hes1和Hes5表达上调，抑制Atoh1基因表达，从而抑制毛细胞和支持细胞的增殖和分化。

Korrapati等［29］通过庆大霉素诱导新生小鼠耳蜗毛细胞缺失，支持细胞形态发生变化，填补毛细胞死亡时残留的裂隙，此时Notch信号通路表达活跃，以不依赖毛细胞的转录调节因子Hes1、Hey1、Hey2、HeyL和Sox2作为目标和潜在的Notch效应器。Notch信号通路抑制剂——γ－分泌酶抑制剂能够使支持细胞分化为毛细胞样细胞，该毛细胞样细胞的细胞学、分子学和基本的电生理学特性与成熟的毛细胞相似。Zhao等［30］运用 DAPT——γ－分泌酶抑制剂，同时过表达Atoh1，培养新生大鼠柯蒂氏器，诱导大量新生毛细胞。

2.6 细胞周期调控 细胞周期蛋白D（cyclinD，cD）在细胞周期调控中起重要作用，能够使哺乳动物毛细胞的细胞周期处于静止期［31］。cD1是影响支持细胞增殖的重要因素，支持细胞增殖能力下降与cD1表达减少有关联，过表达cD1能够刺激支持细胞进入细胞周期而增殖。Loponen等［32］将携带cyclinD1的腺病毒导入小鼠成熟的支持细胞中，异常表达的cyclinD1能够使支持细胞重新进入细胞周期，细胞周期蛋白依赖的激酶抑制因子 （cyclin dependent kinase inhibitors，Ckis）包括2个家族［33］：Ink4家族和 Cip／Kip 家族。Ink4家族包括p15Ink4a、p16Ink4b、p18Ink4c和 p19Ink4d，Cip／Kip 家族包括 p21Cip1、p27Kip1和p57Kip2多肽。p27kip1基因能够使哺乳动物毛细胞细胞周期处于静止期，下调P27kip1能够促进支持细胞的增殖，并且少数支持细胞可分化为毛细胞［34］。

细胞周期负调控因子还有视网膜母细胞瘤蛋白（rentinoblastoma protein，pRb）。pRb是口袋蛋白，可抑制毛细胞进入细胞分裂期。Yu等［35］运用Prox1－CreER （T2）法去掉新生小鼠耳蜗支持细胞中的pRb，支持细胞重新进入细胞周期，进行有丝分裂。

3 展 望

临床实际应用中如必须要使用AmAn来治疗一些难治性、复杂性的疾病［3－5］时，为了避免AmAn的耳毒性，除了要合理用药，还要采取措施进行预防。AAID的发生是环境和遗传共同造成［18－19］。根据AAID的发生机制，可以通过消除细胞中产生的自由基、保护线粒体的功能及其完整性、抑制凋亡通路和基因检测等方法预防AAID的发生。AmAn使毛细胞中ROS水平升高，金属螯合剂可以减轻细胞中ROS对线粒体的损伤［7］。Ding等［9］研究显示：亮抑酶肽能够减轻庆大霉素对毛细胞的损伤。Tabuchi等［36］发现：X连锁凋亡抑制蛋白能够抑制caspase的活动，减轻庆大霉素对毛细胞的损伤作用。线粒体基因存在1555A＞G、1494C＞T、961insC、1095T＞C、961T＞G、1291T＞C和827A＞G等点突变的人群可能对AmAn具有易感性，因此可根据家族中AAID的发生情况进行基因检测。存在mtDNA基因突变的人群，应避免接触AmAn［16－19］。

AAID的基因治疗是一个错综复杂的过程，基因表达、凋亡信号通、细胞周期蛋白和调节因子相互协调，相互制约，共同作用于毛细胞的再生及发育过程，任何一个环节均会影响治疗的效果。Atoh1基因在毛细胞再生过程中起关键作用，其转录受Notch信号通路的抑制［23］。研究［30］表明：单纯过表达Atoh1并不能够使得大多数支持细胞分化为毛细胞，同时抑制Notch信号通路能够促进新生小鼠毛细胞样细胞的再生。DAPT和Atoh1基因过表达作用的部位不完全相同，DAPT在柯蒂氏器顶回诱导更多的毛细胞，Atoh1基因过表达使中回产生更多的毛细胞。细胞周期蛋白D与Ckis在细胞分化、发育、转移和调控细胞周期中共同起关键作用。在成熟小鼠支持细胞内过表达cyclinD1，仅有少数支持细胞能够进入细胞周期，支持细胞中p27Kip1表达减弱，可能与cyclinD1共同促进其重新进入细胞周期［32］。研究［31］显示：19Ink4d／p21Cip1双基因敲除新生小鼠的前庭毛细胞体外培养后，cyclinD1异常表达，毛细胞重新进入S期。Rb蛋白去活性并过表达atoh1基因促进新生小鼠毛细胞再生［35］。

诸多学者研究AAID基因治疗的方法为本文作者进一步的探索提供了思路。在AmAn损伤毛细胞研究中，基因重新表达使毛细胞再生至功能恢复的每个环节中的影响因素都需要考虑，以期能够发现一种效果最好的治疗方式。但是影响基因治疗的很多因素仍然未知，如AAID基因治疗的时间窗，目的基因能否正确安全地导入靶细胞，能否在正确部位表达所需蛋白，能否形成有功能的毛细胞，神经纤维与新生毛细胞能否准确构建传入传出系统，听觉功能能否恢复至正常水平等。因此，如何能够安全有效地达到AAID基因治疗的目的是一个漫长的探索过程，还需要进一步研究。

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