细菌耐药性检测方法的研究进展
2015-04-15马秀清陈良安
马秀清，陈良安
解放军总医院 呼吸科，北京 100853
细菌耐药性检测方法的研究进展
马秀清，陈良安
解放军总医院 呼吸科，北京 100853
明确致病菌的耐药特性是指导各种细菌感染性疾病治疗的关键。常规药敏试验需要从标本中分离出菌株，操作烦琐、费时。近年来，一些分子生物学技术在细菌耐药性检测领域取得了很大进步，但临床应用方面还有待改善。本文重点介绍几种技术在细菌耐药性检测中的新进展，为临床实现细菌耐药性的快速准确检测提供参考。
细菌；抗药性；药敏试验
随着抗生素的使用，耐药菌不断出现，特别是“超级耐药菌”的报道引起了全世界对细菌耐药性问题的关注。因此，谨慎合理地使用抗生素显得尤为重要。快速准确的检测致病菌耐药性是指导合理使用抗生素的关键。常规的药敏试验需要从临床标本中分离出菌株，耗费时间长，且许多生长慢或不容易培养的细菌不能通过药敏试验进行耐药性检测。近年来，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、基因芯片、飞行时间质谱、微流体芯片、全基因组测序等技术在快速检测细菌耐药性方面迅速发展。本文就几种技术在快速检测细菌耐药性方面的新进展进行综述。
1 药敏试验
药敏试验是目前各实验室检测细菌耐药性的常规方法[1]，主要包括肉汤稀释法、琼脂稀释法、K-B纸片法、E-test实验及各种自动化药敏分析系统，如Vitek系统、MicroScan WalkAway系统、Phoenix Automated Microbiology系统等。魏丹丹等[2]采用Vitek 2 Compact和MicroScan Walk Away 40 SI全自动微生物鉴定仪检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)的灵敏度为95.45%和93.18%，特异度为94.12%和92.68%，符合率为94.87%和92.94%，提示两种系统均可用于MRSA的检测，但前提是需要分离临床菌株。药敏试验的优点：有国际化的标准操作流程[3]，敏感性高，肉汤稀释法、琼脂稀释法和E-test试验能够检测药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，指导用药剂量，每种方法均有相应的试剂盒减轻了操作者的负担。缺点：不能直接检测临床标本，需要培养才能鉴定出耐药菌株，培养受限的菌株无法进行药敏试验。可见，药敏试验不能完全满足临床的需求。
2 PCR技术
以PCR为基础的技术包括普通PCR和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)，其原理都是基于目的基因特异片段的扩增。由于每种细菌均有自己的特异基因或片段，所以最初PCR用于菌种的鉴定和定量分析。随着细菌耐药机制研究的进展，PCR也应用于细菌耐药基因的检测中。首先，最具影响力的是采用PCR方法检测金黄色葡萄球菌中mecA基因的表达，从而筛选出MRSA。目前，利用普通PCR或Real-time PCR检测mecA基因及其相关片段的商业化检测系统已经产生，如BD公司的GeneOhm系统[4]和Cepheid公司的GeneXpert系统[5]，均能在数小时内完成对标本的检测。Dalpke等[6]共收集734例鼻拭子、30例肛周拭子和26例外科感染伤口拭子，采用BD Max MRSA全自动检测仪，从标本处理到出结果，共耗时约150 min，灵敏度和特异度分别为93.9%和99.2%。在PCR方法与传统药敏方法比较的研究中显示[7]，PCR使患者得到最佳抗生素治疗的时间缩短了25.4 h。一个多中心报道也提示，GeneXpert系统的灵敏度超过了93%，适合临床应用[4]。PCR技术在耐万古霉素肠球菌的耐药基因vanA和vanB的检测中也有应用，但vanB的假阳性比较高，特异性差[8]。PCR技术检测革兰阴性菌中耐药基因的报道也很多，例如多重real time PCR法检测碳青霉烯类的耐药基因KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48[9]，多重TaqMan PCR法检测质粒介导的AmpC类β-内酰胺酶基因[10]等。
另外，利用Real-time PCR能够定量检测目的基因拷贝数的优势，检测细菌在抗生素环境中的生长情况，可缩短培养时间，这是PCR技术在耐药基因检测中应用的一个新思路。ompA基因在鲍曼不动杆菌中呈恒定表达，能反应鲍曼不动杆菌的生长情况。有报道[11]通过Real-time PCR分别监测多黏菌素、环丙沙星和亚胺培南环境中，两株鲍曼不动杆菌ompA基因的拷贝数，成功地鉴别出了敏感株和耐药株。该方法虽然也进行了培养，但实时荧光定量PCR检测所需样品量少，较传统药敏试验时间短。因此，PCR技术在细菌耐药基因检测的应用中具有快速、灵敏度高的优势，但1次PCR检测的耐药基因数目非常有限。
3 基因芯片技术
基因芯片技术是一种高通量自动化检测技术，其基本原理是将一组已知序列的核酸探针固定在基片上，与未知序列进行杂交，从而达到检测目的，可检测到10 ～ 100个DNA的拷贝数。基因芯片在病原微生物分子诊断方面可用于病原体菌种鉴定、分型、诊断、耐药基因检测等多个领域，一直是研究的热点。在具体操作中，有的将标本全基因组DNA进行随机引物扩增，标记上Cy3荧光染料，与芯片杂交，然后用仪器进行分析，但荧光染料和仪器价格昂贵，分析复杂[12]；有的将PCR和芯片技术相结合，先利用标记的引物扩增出标本DNA特异的目的片段，再与芯片反应，分析结果，适合耐药基因的检测[13]。
近年来，基因芯片技术在细菌耐药基因检测的应用中，也有新的改进，尤其在芯片的试验步骤、信号采集和分析方法等环节进行了各种改进，简化了操作，降低了成本。Naas等[14]利用多重结扎介导PCR技术(multiplex ligation detection reaction，LDR)，一对引物便可扩增出所有的特异片段，然后标记上生物素，与芯片杂交，结果的判读也很方便。该团队对研制的芯片进行不断升级[15-16]，在最新的升级版芯片中可一次性检测超广谱β内酰胺类耐药基因TEM、SHV、CTX-M，质粒介导的头孢菌素类耐药基因CMY-2-like、DHA、FOX、ACC-1、ACT/MIR、CMY-1-like/MOX，碳青霉烯类耐药基因KPC、OXA-48、VIM、IMP、NDM，经临床菌株验证显示，敏感性和特异性均为100%，但还没有直接应用于临床标本。在耐药基因检测方面也有相关的试剂盒通过了FDA批准，如Curetis公司的UnyveroTMP50试剂盒[17]，敏感性为55% ～ 100%，特异性为72.3% ～ 100%。该试剂盒采用了多重PCR扩增标本中目的片段，4 h出结果，能检测22种耐药基因，包括β内酰胺类、氟奎诺酮类和1类整合子耐药基因。
在我国，军事医学科学院研发了一种利用新型纳米金标底物信号放大技术代替传统的荧光标记技术[13]。其原理是将下游引物标记生物素，经多重PCR与芯片杂交后，洗去未结合的带生物素标记的引物片段，再与连有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的亲和素分子结合，HRP可催化酪胺分子大量沉积在其表面，起到级联放大的作用，将灵敏度提高10 ～ 100倍，结果肉眼可见，形成可视化基因芯片，无需信号采集和分析仪器，很大程度上降低了成本，非常适合临床体外诊断。对于难培养的结核分枝杆菌，我国国家食品药品监督管理局(CFDA)批准了北京博奥生物有限公司生产的结核分枝杆菌耐多药基因芯片检测试剂盒，其原理基于katG、inhA和rpoB基因突变导致对利福平和异烟肼多药耐药的机制，分离株或痰标本均可检测，6 h内出结果[18]，而传统的培养方法需要4 ～ 6周，该试剂盒极大缩短了检测时间，有利于指导临床用药。
4 飞行时间质谱
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种新型的软电离生物质谱。其原理是先将生物分子电离，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同形成蛋白质指纹谱，然后经软件与数据库中标准指纹图谱进行对比，即可确定所检微生物的类型，具有灵敏度高、准确、快速的优势。
MALDI-TOF MS技术主要应用于菌种的鉴定，而在致病菌耐药性方面的检测还有争议。Edwards-Jones等[19]曾利用MALDI-TOF MS技术成功分辨出甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus，MSSA)。但2013年证实该技术能够区分MRSA和MSSA，不是因为敏感和耐药的区别，而是由于金葡菌克隆谱系的不同[20]。因此该技术不能直接用来鉴定MRSA和MSSA。如何将MALDI-TOF MS技术成功应用于致病菌的耐药性检测呢？Hrabak等[21]利用耐药菌株水解抗生素产生的产物来反映菌株的耐药性，在124株肠杆菌和铜绿假单胞菌中，利用MALDI-TOF MS技术检测美罗培南的水解产物，准确地反应了碳青霉烯酶的活性，敏感性和特异性分别为96.67%和97.87%。Hrabak等[22]也利用该方法通过抗生素水解产物指纹谱峰值的不同，成功地检测到了肠杆菌中VIM-1、KPC、OXA-48和OXA-162耐药基因和鲍曼不动杆菌中NDM1耐药基因。虽然MALDITOF MS技术在致病菌耐药性方面的研究取得了一定的进展，但该技术影响因素很多，需要制定标准的操作流程，此外标准指纹谱库还有待完善。
5 微流体芯片
微流体芯片是随着微电子、微机械、生物工程和纳米技术的发展而产生的，可以在几平方厘米的芯片上完成分子生物所涉及的样品处理、反应、检测等复杂的操作，实现常规实验室的各种功能，所以又称为芯片实验室。Choi等[23]在含有琼脂糖的微流体装置中，显微镜追踪观察单个细胞在抗生素下的生长情况，比传统的药敏试验时间短，3 ～4 h就可以提供MIC值。该方法还在不断地改进中，如通过抗生素下细菌代谢产物pH值的变化来检测细菌的生长[24]，通过荧光染色观察抗生素下细菌的生长情况[25]。目前有报道微流体芯片可直接检测患者尿液标本，3.5 h内出结果，与传统药敏试验相比，有94%的符合率[26]。但还没有直接检测临床其他类型标本的研究。微流体芯片由于体积微小，所以具有快速、高通量、低消耗的优点，但也是由于体积微小很容易受一些因素干扰，如静电、pH值、温度等。另外微流体芯片需要辅助操作设施，价格昂贵，需要经过培训的专业人员操作。该技术还处于早期实验室研发阶段。
6 全基因组测序
随着人类基因组计划的完成，全基因组测序也渗透到各个研究领域，包括细菌耐药方面的研究。全基因组测序能够提供检测样品的完整序列，通过数据库分析可发现大量的信息，但价格贵，分析时间长，一直用于某些特殊菌株的测序。Zankari等[27]提出将全基因组测序应用于临床常规检测的观点，并收集了200株菌，包含伤寒沙门杆菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、屎肠球菌4个菌种，将所有菌株全基因组测序结果和药敏试验比较，符合率为99.74%，可见全基因组测序基本能正确反应细菌的耐药性。在我国，朱健铭等[28]利用高通量测序技术对泛耐药肺炎克雷伯菌JM 45株做了全基因组测序，得到该菌株1条完整的基因组序列及2条质粒序列，其中基因组序列中携带了耐药基因gyrA和parC，与肺炎克雷伯菌喹诺酮类药物敏感株比较，gyrA基因第83位密码子TCC→ATC突变，parC基因第80位密码子AGC→ATC突变，为该菌株耐药机制的研究奠定了基础。另外，全基因组测序在多药耐药菌株暴发流行时起到了重要的作用，如MRSA在美国多家医院的暴发流行时，通过全基因组测序，比较金黄色葡萄球菌敏感株和耐药株序列的差异，对耐药株的耐药机制进行了充分研究[29]；大肠埃希菌(E. coli O104：H4)在德国的暴发流行时，同样是全基因组测序使人们更充分的认识到了E. coli O104：H4的耐药机制[30]。因此在耐药菌暴发初期，积极地进行耐药菌全基因组测序是十分必要的。
7 结语
细菌耐药性检测主要包括药敏试验和耐药基因检测。由于药敏试验需要2 ～ 3 d出结果，这期间临床医生只能依靠经验性治疗。而以上几种耐药基因检测方法以其较高的敏感性和特异性，可以在药敏试验结果出来前为临床提供参考，减少经验性治疗，提高疗效。但基因检测方法也存在不足：1)PCR、基因芯片、飞行时间质谱和微流体芯片技术不能检测到新的耐药机制，可导致治疗不足；2)PCR、基因芯片、飞行时间质谱和全基因组测定技术不能确定含有耐药基因的菌株是否处于耐药状态，容易产生过度治疗；3)PCR、基因芯片、飞行时间质谱和全基因组测定技术不能提供MIC值，无法指导临床用药剂量。目前我国虽然有很多细菌耐药性检测的基础研究，也有些试剂盒经过了CFDA的批准，但检测的范围还十分局限，临床应用仍然受限。因此，还需不断努力探索更实用、更快速、更准确的细菌耐药性检测方法。
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Advances in detection of bacterial drug resistance
MA Xiuqing, CHEN Liang'an
Department of Respiratory Diseases, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
CHEN Liang'an. Email: chenliangan301@163.com
The detection of bacterial drug resistance is essential for guiding the treatment of many types of bacterial infections. The most commonly employed method is antimicrobial susceptibility testing. This method requires that the pathogens are isolated from the clinical samples before testing, and it is complicated and also takes time. In recent years, some molecular biology techniques have made great progress in the detection of bacterial drug resistance, but still need to be improved in clinical practice. This paper aims to highlight several techniques and provide references for rapid pathogen resistance detecting in clinical practice.
bacteria; drug resistance; drug sensitivity test
R 446.5
A
2095-5227(2015)04-0404-04
10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.027
时间：2014-12-12 10:53
http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141212.1053.003.html
2014-09-16
北京市科技专项(Z121107002812029)
Supported by the Beijing Science and Technology Program(Z1211070028 12029)
马秀清，女，硕士，主管技师。研究方向：肺炎致病菌的耐药机制。
Email: mxq820812@163.com
陈良安，主任医师，博士生导师。Email: chenliangan301 @163.com
