双特异性磷酸酶-1过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭的影响

巩会杰，牛少曦，李世超，沈东来，顾良友，李新涛，高 宇，张 瑜，马 鑫，姚远新，张 旭

解放军总医院 泌尿外科，北京 100853

双特异性磷酸酶-1过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭的影响

巩会杰，牛少曦，李世超，沈东来，顾良友，李新涛，高 宇，张 瑜，马 鑫，姚远新，张 旭

解放军总医院 泌尿外科，北京 100853

目的构建携带人双特异性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1，DUSP-1)基因的过表达慢病毒载体并包装病毒，感染人肾癌细胞株A498后观察DUSP-1的过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭能力的影响。方法从pCMV6-XL5-DUSP-1质粒上获得目的基因片段，采用DNA重组技术将DUSP-1基因插入到慢病毒表达载体质粒Plv-EGFP(2A)Puro中，获得重组plv-EGFP(2A)Puro-DUSP-1载体。重组慢病毒表达质粒及辅助包装质粒pH1、pH2共转染293T细胞进行慢病毒包装，收集病毒上清并感染肾癌细胞株A498，利用Western blot检测细胞DUSP-1蛋白的表达情况。用MTS法检测细胞增殖能力的变化，Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果成功构建携带DUSP-1过表达载体。包装病毒后成功感染A498细胞株，DUSP-1蛋白表达较对照A498细胞株显著上调。重组质粒组细胞在490 nm吸光值明显上升(P＜0.05)；细胞侵袭试验中，重组质粒组的穿膜细胞数明显高于空载体组(P＜0.05)。结论成功构建了人DUSP-1基因的重组慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1，进行病毒包装后成功培养稳定高表达DUSP-1基因的肾癌细胞株；DUSP-1基因的过表达具有促进肾癌细胞株A498增殖和侵袭的作用。

双特异性磷酸酶-1；肾癌细胞株A498；基因表达调控，肿瘤

双特异性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1，DUSP-1)是由早期应答基因编码的一种双向特异性的苏/酪氨酸磷酸酯酶，主要分布于细胞核内，在丝裂酶原蛋白活化激酶MAPK(细胞外信号调节激酶ERK，p38和c-jun氨基末端激酶JNK)的去磷酸化和失活方面发挥重要作用。MAPK信号传导通路是与肿瘤发生、发展、侵袭、转移及凋亡相关的重要信号传导通路之一，DUSP-1能使活化的MAPK家族成员去磷酸化而失去活性，进而在肿瘤的发生、转移及肿瘤细胞的凋亡等方面发挥重要作用[1-2]。本研究旨在构建带有DUSP-1基因的重组慢病毒表达载体后进行病毒包装，并通过感染A498筛选得到稳定高表达DUSP-1基因的肾癌细胞株，探讨其对A498肾癌细胞增殖和侵袭能力的影响。

材料和方法

1材料 293T人肾小管上皮细胞、A498肾癌细胞株由本实验室培养。胎牛血清FBS购自美国Gibco公司、DMEM高糖培养基、MEM/EBSS培养基购自美国Hyclone公司。6 cm和96孔细胞培养皿购自美国Corning公司。慢病毒包装系统购自北京英茂盛业公司[含pLV-EGFP(2A)Puro表达载体、pH1和pH2辅助载体]。含人DUSP-1的CDS片段质粒pCMV6-XL5购自美国Origene公司。XbaⅠ限制性内切酶，BamHⅠ限制性内切酶、T4-DNA连接酶购自日本TAKARA公司。核酸染料Gelred购自美国Biotium公司，DNA凝胶回收试剂盒购自美国Promega公司，PCR Taq Master Mix、质粒小提试剂盒、DNA产物纯化试剂盒购自北京天根公司，感受态细胞DH5α购自于北京全式金公司。脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，PCR引物合成、测序由Genewiz公司完成。DUSP-1抗体购自于美国MILLIPORE公司；羊抗兔、羊抗鼠抗体购自北京中杉金桥公司。MTS试剂购自美国Promega公司，Transwell小室、Matrigel基质胶购自美国BD公司。

2DUSP-1基因的扩增 从pCMV6-XL5-DUSP-1质粒上扩增DUSP-1基因，在引物上游和下游分别加入XbaⅠ和BamHⅠ黏性末端和保护碱基，引物序列为：上游5'-TGCTCTAGAATGGTCATGGAAGT GGGCA-3'；下游5'-CGCGGATCCTCAGCAGCTG GGAGAGGT-3'。PCR反应体系：模板1 μl、Taq Master Mix 10 μl、上下游引物共1 μl、ddH2O 8 μl。PCR扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸1 min共35个循环，72℃延伸10 min，回收反应产物。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，Gelred染色，利用凝胶成像观察电泳结果。

3重组慢病毒质粒 pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1的构建、鉴定PCR获得的DNA片段和载体同时酶切。酶切体系：20 μl×5：限制性内切酶XBaⅠ1 μl、限制性内切酶BamHⅠ1 μl、KBuffer 1 μl、质粒DNA 1.5 μl(530 ng/μl)/片段DNA 1 μl(780 ng/ μl)、分别加H2O至20 μl。37℃酶切4 h后行DNA电泳，进行目的片段胶回收。纯化后测量浓度，将目的片段与载体连接。连接体系10 μl：T4 Ligase 1 μl、Buffer 1 μl、质粒DNA 5 μl(120 ng/ μl)/片段DNA 3 μl(68 ng/μl)。16℃连接过夜；将连接产物10 μl转化入DH5α感受态细胞，接种于带有氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养12 ～ 14 h；挑克隆、摇床摇菌(37℃、200 r/min、14 ～ 16 h)；质粒提取；酶切鉴定(设置空载体对照)；将DNA电泳正确的质粒送测序。

4慢病毒包装与感染 待293T细胞达70% ～ 80%融合时进行感染，分别将5 μg重组病毒载体、空载体与3.75 μg pH1质粒、1.25 μg pH2质粒按照Lipofectamine 2000说明书混合制成感染液，感染4 ～ 6 h后更换高糖培养基。48 h时收集细胞培养上清，10 000 r/min离心10 min，上清用0.45 μm的滤膜过滤后备用。将对数A498细胞接种于6 cm培养皿，待生长至融合度达70% ～ 80%时进行病毒感染，感染时加入1 ml病毒上清+ 3 μl Polybrene + 2 ml 10% FBS的EBSS培养基轻轻摇匀，24 h更换1次培养基，第5天在荧光显微镜下观察荧光表达。

5Western blot检测DUSP-1蛋白表达 收集感染的A498细胞，裂解后取40 μg左右处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，DUSP-1一抗1∶2 000稀释后4℃孵育过夜，TBST洗膜3 min×5次，然后与山羊抗兔二抗1∶3 000，37℃孵育1 h，TBST洗膜3 min×5次，HRP-ECL法曝光，监测目的蛋白的表达。

6MTS法检测A498细胞增殖 实验设置重组质粒组和空质粒组，按照每孔5 000个细胞密度接种于96孔板中，在37℃、5% CO2培养24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加20 μl MTS试剂，继续培养1 h后，用酶标仪测定490 nm波长各孔吸光值。每组设置3个复孔，重复3次。

7Transwell检测细胞侵袭能力 用1% FBS培养基制备细胞悬液，调整细胞浓度为2×104/ml；向24孔板中加入500 μl含20% FBS的EBSS培养基；向每个小室中加100 μl制备的细胞悬液(于接种细胞前12 h在小室中铺Matrigel基质凝胶)，温箱中孵育24 h；用棉签将小室上层未侵袭的细胞轻轻擦掉；将500 μl结晶紫染料加入24孔板未占用的孔中，将小室放入染料中，室温避光染色20 min；将小室浸入盛有去离子水的烧杯中充分冲洗，用棉签将小室上层未侵袭的细胞轻轻擦掉，超净台吹风干燥；显微镜下观察照相，100倍镜视野下随机选取5个视野进行细胞计数。

8统计学方法 数据以表示，应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1PCR法获取目的基因片段 取PCR产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳，显示在约1 100 bp处有扩增条带，片段与预期值一致，表明目的基因克隆成功(图1)。

2重组慢病毒质粒的构建鉴定和测序 重组表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1经XBaⅠ、BamHⅠ双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳也显示1 100 bp处的DUSP-1片段(图2)。重组表达载体测序结果分析显示，所插入的序列与理论序列完全一致，表明DUSP-1重组慢病毒表达质粒构建成功。

3慢病毒包装结果 重组质粒与空质粒慢病毒感染A498细胞后第5天荧光倒置显微镜观察绿色荧光表达情况(图3)，感染效率为90%以上。Western blot法检测DUSP-1蛋白表达，结果显示，重组质粒组的DUSP-1表达显著升高(图4)。

4MTS法检测A498细胞增殖 两组细胞培养后，感染重组质粒组A498在铺板后24 h、48 h、72 h、96 h的吸光值较空质粒组明显增加，细胞增殖能力明显增强(P＜0.05，图5)。

5Transwell检测细胞侵袭能力 重组质粒组穿膜细胞数为122±15，空质粒组穿膜细胞数为77±9。重组质粒组A498细胞的穿膜细胞数比空质粒组增加60%(P=0.01)，侵袭能力明显增强(图6)。

图 1 DUSP-1基因的PCR扩增产物电泳图M：200 bp标记物； 1 ～ 2： PCR扩增产物图 2 重组慢病毒质粒酶切鉴定图M：200 bp标记物； 1： 重组质粒； 2： 空质粒Fig. 1 Electrophoresis of DUSP-1 PCR productM: 200 bp Marker; 1-2: PCR productFig. 2 Enzyme cleave identification of the recombinant plasmidM: 200 bp Marker; 1: Recombinant plasmid; 2: Empty plasmid

图 3 转染后GFP表达情况(×100) A：空质粒组；B：重组质粒组Fig. 3 Expression of GFP after transfection (×100) A: Empty plasmid; B: Recombinant plasmid

图 4 Western blotting检测结果1： 转染重组质粒组； 2： 转染空质粒组Fig. 4 Western blotting result 1: Empty plasmid; 2: Recombinant plasmid

图 5 重组质粒组的MTS于各个时间点在490 nm处光吸收值较空质粒组明显增高(P＜0.05)Fig. 5 Absorbance of the recombinant plasmid group at different time points were significantly higher comparing with empty plasmid group (P＜0.05)

图 6 A498细胞侵袭实验 A： 空质粒组； B：重组质粒组Fig. 6 A498 cell invasion assay A: Empty plasmid; B: Recombinant plasmid (aP=0.01)

讨 论

MAPK信号传导通路是与肿瘤发生、发展、侵袭、转移及凋亡相关的重要信号传导通路之一，作为MAPKs内源性抑制剂的DUSP-1就成为了一个非常有潜在研究价值的调控因子。多数研究也表明，DUSP-1基因的异常表达与多种肿瘤的发生、发展、转移、凋亡、抗药性及缺氧诱导机制相关[3-5]。有研究表明，DUSP-1与非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)的血管生成、侵袭和转移有关，敲低DUSP-1在NSCLC细胞中的表达可以提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性[6-8]。DUSP-1在胰腺癌细胞中的高表达能促进体内的肿瘤形成，靶向作用于DUSP-1后，吉西他滨能更高效地诱导胰腺癌细胞的凋亡[9]。DUSP-1的表达与乳腺癌的进展呈正相关，是乳腺癌不良预后的独立危险因素，同时也是是介导肿瘤化疗抵抗的重要因素[10-11]。这些都说明，DUSP-1在肿瘤的发生、发展中作为促癌基因发挥作用。然而在前列腺癌的研究中，DUSP-1的表达水平随着肿瘤分期的升高而降低，过表达DUSP-1后能促进前列腺癌细胞DU145的凋亡[12]。在子宫内膜癌中，DUSP-1的表达下降可作为肿瘤进展以及发生恶性转移的潜在标记物[13]。肾透明细胞癌恶性程度高，对放疗、化疗均不敏感，与肿瘤进展相关的功能机制研究尚未有明确结果[14-17]。有研究描述肾透明细胞癌中抑制DUSP-1的表达可以增加JKN相关的细胞凋亡[18]。基于此我们设计了实验，研究过表达DUSP-1在肾癌细胞系中的作用。

本实验以慢病毒载体pLV-EGFP(2A)Puro为基础，成功构建含有人DUSP-1基因的重组慢病毒质粒pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1，经过包装得到病毒颗粒并感染人肾癌细胞株A498，获得了可稳定高表达DUSP-1的A498-DUSP-1细胞。本实验构建的A498-DUSP-1细胞增殖速度明显提高，细胞的侵袭能力显著增强，初步说明DUSP-1在肾癌的发展及转移过程中有促进肿瘤生长、增强肿瘤侵袭力的作用。

本实验为后期DUSP-1基因在肾癌细胞生物学功能研究及动物模型的建立奠定了一定的实验基础。对肾透明细胞癌DUSP-1信号通路的研究，有助于进一步阐明肾透明细胞癌的发生、发展机制，为肾癌的治疗及预后评估提供新的思路。

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Effect of DUSP-1 overexpression on proliferation and invasion of renal cell carcinoma cell line A 498

GONG Huijie, NIU Shaoxi, LI Shichao, SHEN Donglai, GU Liangyou, LI Xintao, GAO Yu, ZHANG Yu, MA Xin, YAO Yuanxin, ZHANG Xu

Department of Urology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

ZHANG Xu. Email: xzhang@foxmail.com

ObjectiveTo construct the pLV-EGFP (2A) Puro-DUSP-1 lentiviral expression vector and package virus and observe the effect of DUSP-1 overexpression on proliferation and invasion of human renal cell carcinoma cell line A498.MethodsThe target gene obtained from pCMV6-XL5-DUSP-1 was cloned into Plv-EGFP (2A) Puro vector by recombinant DNA technology. The recombinant lentiviral vector pLV-EGFP (2A) Puro-DUSP-1 was co-transfected into 293T cells with packaging plasmids pH1 and pH2 to package virus. The A498 cell line was infected by virus supernatant, and then western blot was used to detect the expression of DUSP-1 protein. The effects of DUSP-1 on proliferation and invasion of A498 cells were analyzed using MTS and Transwell method.ResultsAfter successful construction of the recombinant pLV-EGFP (2A) Puro-DUSP-1 lentiviral expression vector, packaging of lentiviral particles and transfection of A498 cell line, the expression of DUSP-1 was significantly upregulated in protein level compared with the empty vector group. MTS assay showed that the absorbance in the recombinant vector group was significantly increased after transfection (P＜0.05) and transwell assay showed that cell invasion numbers in the recombinant vector group were also increased compared with the empty vector group (P＜0.05).ConclusionRecombinant pLV-EGFP (2A) Puro-DUSP-1 lentiviral expression vector is successfully constructed and the lentiviral particles are successfully packaged. The overexpression of DUSP-1 can significantly increase cell proliferation and invasion of A498 cell line.

dual specificity phosphatase 1; renal carcinoma cell line A498; gene expression regulation, neoplastic

R 737.11

A

2095-5227(2015)04-0379-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.021

时间：2014-12-29 10:53

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141229.1053.001.html

2014-10-17

基金课题：国家高技术研究发展计划(863)资助课题(2012AA021100)

Supported by the National High Technology Research and Development Program of China ("863" Program)(2012AA021100)

巩会杰，男，在读硕士。Email: urologhj@qq.com

张旭，男。Email: xzhang@foxmail.com