西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选

杨晓丹，原现军，郭刚,2，崔棹茗，李君风，白晰，巴桑，邵涛*

(1.南京农业大学,饲草调制加工与贮藏研究所,江苏 南京 210095； 2.山西农业大学动物科学技术学院,山西 太谷030801；3.西藏日喀则地区草原工作站，西藏 日喀则 857000)



西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选

杨晓丹1，原现军1，郭刚1,2，崔棹茗1，李君风1，白晰1，巴桑3，邵涛1*

(1.南京农业大学,饲草调制加工与贮藏研究所,江苏 南京 210095； 2.山西农业大学动物科学技术学院,山西 太谷030801；3.西藏日喀则地区草原工作站，西藏 日喀则 857000)

本研究对西藏地区豆科牧草青贮饲料中的乳酸菌进行分离、鉴定，以期得到优良的乳酸菌菌株。以苜蓿和箭筈豌豆青贮饲料为试验材料，共分离得到6株同型发酵乳酸菌，经传统微生物培养和16S rRNA序列分析，3株(LCG9，CG35和AG11)为戊糖片球菌，2株(LCG3和LAG1)为植物乳杆菌，1株(LA3)为弯曲乳杆菌；除AG11和LAG1在5℃，LCG9和AG11在pH 3.0和8.0生长微弱外，其余乳酸菌菌株均在5～20℃，pH 3.0～8.0及3.0%和6.5% NaCl培养液中生长良好。从耐低温特性、产酸能力和发酵速率3个指标考虑，植物乳杆菌LCG3最适宜用于西藏青贮饲料生产的乳酸菌菌种。

豆科牧草；青贮饲料；乳酸菌；分离；鉴定

西藏自治区是我国五大牧区之一，畜牧业是西藏农业经济的主导产业。但是青藏高原平均海拔高达4000 m，自然气候条件恶劣，寒冷季节长达7～9个月，导致牧草生长期短，季节性饲草不平衡，畜牧业生产陷入“夏肥、秋壮、冬瘦、春死”的恶性循环。为了满足牧区反刍家畜冬春季节对饲草料的需求，将农区富余的牧草及农作物秸秆调制成优质青贮饲料是解决牧区畜牧业发展困境的有效途径之一[1-3]。

青贮原料中乳酸菌的种类、数量及活性是影响青贮饲料发酵品质的重要因素，早期的研究[4]发现在西藏青贮饲料生产中，添加商品乳酸菌制剂未能有效地改善青贮饲料的发酵品质，可能是由于商品乳酸菌制剂适宜生长温度在30℃左右，难以适应西藏高海拔、低温和缺氧的极端气候条件，其性能发挥受到了限制。因此发掘和利用青藏高原特有的本土乳酸菌种质资源，发挥其适应性强的特性，对于该地区优质青贮饲料的生产，促进畜牧业的发展具有重要意义。

近年来，国内外有关牧草中附着乳酸菌或青贮饲料中乳酸菌的收集、分离、鉴定及其在青贮饲料生产中的应用备受关注。大部分研究结果表明[5-10]，青贮饲料中分离得到的优良乳酸菌均能明显改善青贮发酵品质；部分异型乳酸菌还能抑制青贮饲料有氧暴露期间的腐败变质，提高其有氧稳定性。有关研究报道[2]，在我国高海拔、低温和缺氧的极端环境中进行牧草青贮时能够得到优质青贮饲料，几乎没有有氧腐败现象发生，由此可以推测在我国青藏高原地区存在着适应于极端环境的特殊乳酸菌种质资源。

紫花苜蓿(Medicagosativa)和箭筈豌豆(Viciasativa)是西藏主要的栽培豆科牧草，具有适应性强、适口性好、蛋白质含量及营养价值高等特点，经常与禾本科牧草以混合青贮方式生产青贮饲料。本研究旨在从西藏豆科牧草青贮饲料中分离生物学特性优良的乳酸菌菌株，从而为西藏青贮饲料添加剂的研发和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

紫花苜蓿和箭筈豌豆种植于西藏日喀则地区草原工作站试验田(平均海拔3836 m，北纬29°16′，东经88°51′)；该地区属于高山亚寒带半干旱季风气候，年均降雨量为422.4 mm，气温6.3℃，日照时数3233 h。紫花苜蓿和箭筈豌豆均处于结荚期，于2013年9月28日刈割，刈割后在田间用铡刀切成2 cm左右，装填至实验室青贮窖中压实密封，置于室温条件下保存，分别在青贮第5天，45 d时开窖取样，对青贮饲料中乳酸菌进行分离鉴定。紫花苜蓿和箭筈豌豆青贮5和45 d各5个重复，共计20个青贮窖；实验室青贮窖，为容积2 L的圆柱状塑料容器，有内外两层盖，便于密封保存。

1.2 培养基，试剂及主要仪器设备

葡萄糖酵母蛋白胨(GYP)培养基和MRS培养基参考Cai等[6]的方法配制，营养琼脂培养基，虎红琼脂培养基购自南京寿德试验器材有限公司。

API CHL培养基和API 50 CH试剂条购自法国BioMerieux公司，DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司，PCR合成引物由上海英潍捷基生物科技有限公司合成。

主要仪器设备：恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜(OLMPUS)、立式压力蒸汽灭菌器、PCR仪、超低温冰箱、凝胶成像仪、电泳仪、紫外分光光度计(日立，U-2910)、pH计(HANNA pH211型)。

1.3 原材料的微生物成分分析

采用平板培养方法进行微生物计数，在超净工作台中采用四分法取原材料样品10 g，放入90 mL的无菌生理盐水密封，置于常温摇床上摇动2 h。用无菌生理盐水适当稀释，取3个适宜梯度涂板，每个梯度2个平行。乳酸菌选用MRS培养基，好氧菌选用营养琼脂培养基，霉菌和酵母菌选用虎红琼脂培养基，置于35℃恒温培养箱中培养2～3 d计数。

1.4 乳酸菌的分离与纯化

分别取青贮5 和45 d后的青贮饲料同上述步骤进行稀释，选用GYP培养基进行乳酸菌的分离培养，挑选具有黄色透明环的菌株分离，在MRS固体培养基上划线培养，35℃ 2～3 d，重复划线分离培养3次，得到纯化的单菌株。然后根据菌落的颜色、大小、光泽、形状等选取典型菌株进行革兰氏染色，油镜镜检，过氧化氢酶试验；凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步认定为乳酸菌菌株[2]，在MRS液体培养基中富集(35℃ 24 h)后加入等体积40%的甘油，分装，-20℃保存，备用。

1.5 乳酸菌的生理生化特性检测

1.5.1 不同温度水平生长试验 将配制好的MRS培养液以每试管5 mL的量分装好，在121℃高压条件下灭菌15 min，将待测菌株培养液，以相同的接种量(0.1 mL)接入培养液中摇匀，塞子封口，分别置于5，10，15和20℃恒温培养箱中培养，其中5和10℃培养5～7 d，其余培养3 ～5 d，观察菌株的生长情况。

1.5.2 不同pH和盐浓度水平生长试验 用盐酸或氢氧化钠将MRS培养液pH调至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5和8.0等7个水平，用分析纯NaCl将MRS培养液的盐浓度调至3.0%和6.5%两个水平，同上述步骤，将待测菌株培养液以相同的接种量(0.1 mL)接入已灭菌培养液中，置于35℃恒温培养箱培养2 d后，观察试验菌株的耐酸碱能力。

1.5.3 糖发酵试验 使用包含49种不同碳水化合物和一个对照的API 50 CHL进行不同糖，醇发酵鉴定，在35℃条件下培养48 h后测定发酵结果。具体方法按照试剂盒的说明进行。

1.6 乳酸菌菌株的16S rRNA序列测定

取30℃条件下培养12 h的培养液各1 mL，13000 r/min离心10 min，沉淀物用于DNA提取，具体的操作方法严格按照试剂盒说明进行。PCR选用细菌16S rRNA V3区通用引物：27 f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 r(5′-TACCTTGTTACGACT-3′)。PCR反应体系包括：2×PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反应程序为：预变性，94℃，5 min；变性，94℃，30 s；退火，55℃，30 s；延伸，72℃延伸1 min，共35个循环。PCR纯化产物送样测序(上海英潍捷基生物科技有限公司)。

用BLAST将所测定菌株的16S rRNA序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行比对，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种，分析相似性。然后用MEGA6.0中的Clustal W对最近类群的序列进行多重比较分析，并通过该软件的邻近法(neighbor joining)构建系统发育树，分支聚类的稳定性用Bootstrap方法进行2000次随机重复取样评价[2]。

1.7 优良乳酸菌菌株的筛选与确定

将分离并鉴定的菌株以3%的接种量接入已灭菌的MRS液体培养基中，于35℃恒温培养箱中培养48 h；每隔4 h取1次样品，测定培养液的pH值，以培养时间为横坐标，pH值为纵坐标，绘制生长曲线；用培养液做空白，在波长600 nm下测定样品的吸光度值(OD值)，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 微生物计数

试验用紫花苜蓿和箭筈豌豆原材料中微生物成分如表1所示。 乳酸菌的数量较少，均为103cfu/g FW，霉菌数量为104cfu/g FW；箭筈豌豆中好氧菌的数量多于紫花苜蓿，达到3.2×107cfu/g FW，但酵母数量低于紫花苜蓿，只有3.0×103cfu/g FW。

2.2 乳酸菌的分离

挑选GYP培养基上具有黄色溶菌环的菌株分离，初步分离出86株乳酸菌菌株进行革兰氏染色、镜检、过氧化氢酶试验、通过不同温度、不同pH和耐盐性试验的比较，分离得到24株耐低温、低pH的乳酸菌菌株，再对其进行生长产酸试验，共得到6株生长迅速、产酸快的优良乳酸菌菌株。菌株来源如表2所示：苜蓿青贮饲料共分离得到3株乳酸菌菌株，早期分离得到AG11，晚期分离得到LAG1和LA3；CG35来自发酵5 d箭筈豌豆青贮饲料，LCG3和LCG9分离于发酵45 d的箭筈豌豆青贮饲料。

表1 苜蓿和箭筈豌豆微生物分析

cfu:Colony forming unit；FW:鲜重Fresh weight.

2.3 乳酸菌的生理生化特性

乳酸菌的表型特征及生理特点如表3所示。6株乳酸菌菌株均为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、同型发酵乳酸菌，其中LCG9，CG35和AG11为乳酸球菌；LAG1，LA3和LCG3为乳酸杆菌。AG11和LAG1在5℃生长微弱，10～20℃生长旺盛；其余乳酸菌菌株均能在5～20℃范围内表现出很强的生长活力。不同pH值和盐浓度条件下的生长情况为：除LCG9和AG11在pH 3.0，pH 8.0条件下生长微弱外，其余乳酸菌菌株均能在pH值为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5和8.0内生长；所有乳酸菌菌株在3.0%和6.5%NaCl条件下生长旺盛，表明分离出的乳酸菌菌株具有耐低温、耐酸碱和强的耐盐特性。

乳酸菌菌株的糖发酵试验结果如表4所示：6株乳酸菌菌株均能利用核糖，半乳糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，N-乙酰-葡萄糖胺，熊果苷，七叶灵，麦芽糖和海藻糖产酸。除LA3外，其余乳酸菌菌株均可利用L-阿拉伯糖，苦杏仁甙，纤维二糖和龙胆二糖，微弱利用葡萄糖酸盐。从利用D-松二糖和山梨醇的情况来看，LAG1，LCG3和LA3可以利用其发酵产酸，但LCG9，CG35和AG11不能；除此之外，LAG1和LCG3能够发酵甘露醇，α-甲基-D-甘露糖苷，水杨苷，乳糖，蜜二糖，蔗糖，松三糖和D-棉籽糖，而其余乳酸菌菌株不能。

2.4 分离乳酸菌菌株的16S rRNA基因序列分析

结合图1系统进化树和表5分离乳酸菌菌株的16S rRNA序列分析结果可知：LCG9，CG35和AG11与戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)的进化亲缘度均为100%，LA3与弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)为97%，与对应标准菌序列相似性分别为100%，100%，100%和99.9%；因此，LCG9、CG35和AG11被准确地鉴定为戊糖片球菌，LA3为弯曲乳杆菌。LAG1和LCG3与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和戊糖乳杆菌(Pediococcuspentosaceu)处于同一族群，进化亲缘度达到100%，并具有99.9%的序列相似性，故只通过16S rRNA序列比较，无法确定他们的种族。LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3和LA3在基因库中的登录号分别为：KJ806296，KJ806305，KJ806309，KJ806295，KJ809299和KJ806306。

表2 青贮饲料中分离的乳酸菌菌株

表3 青贮饲料中分离出的乳酸菌的特性

注：“+”阳性，“-”阴性；“W”弱阳性。

Note:“+”positive,“-”negative,“W” weakly positive.

2.5 分离的乳酸菌菌株的产酸及生长特性

分离乳酸菌菌株的产酸速率曲线如图2所示，LAG1和LCG3的产酸速率最快，它们在0～8 h产酸迅速，8～12 h逐渐变缓，12 h以后趋于平稳。其中LCG3早期产酸最快，培养12 h后，培养液pH降至3.9；16 h之后与LAG1表现出相似的产酸速率。LCG9，CG35，AG11和LA3在整个发酵过程中培养液pH值保持持续缓慢的下降趋势，在发酵结束48 h时分别达到最低值3.82(LCG9)，3.83(CG35)，3.91(AG11)和3.95(LA3)，pH值均达到4以下，同样具备较强的产酸能力。

表4 分离出乳酸菌的糖发酵特性

注：“+”生长，“++”生长良好，“-”不生长,“W”微弱生长。

Note:“+”growth,“++”growth well,“-”non-growth,“W”growth weakly.

不同菌株的生长速率曲线见图3，分离乳酸菌菌株的生长特性均为对数生长曲线；LCG3和LAG1在发酵过程中没有明显的迟滞期，培养0～2 h开始进入对数生长期，2～8 h生长速度达到最快，8～10 h开始进入稳定期，16 h OD值分别达到2.512和2.382；在整个培养过程中，LCG3的生长速度最快，这一结果与产酸速率结果基本一致。LCG9，CG35，AG11和LA3生长速率较缓慢，早期培养迟缓期长，但后期培养基中细胞浓度较高，20 h后OD值分别为2.203(LCG9)，2.185(CG35)，2.114(AG11)和2.185(LA3)，也表现出良好的生长特性。

3 讨论

乳酸菌数量和活性是抑制不良微生物生长和减少发酵损失的一个重要因素，发酵品质取决于青贮材料上初始乳酸菌数量和底物含量[8]。但自然条件下，植物本身附着的乳酸菌数量较低，而且主要为异型乳酸菌[9]，难以保证青贮发酵品质。Pang等[11]曾报道：保证青贮发酵成功的最低乳酸菌数量为105cfu/g FW，本试验中，西藏地区箭筈豌豆和紫花苜蓿表面附着乳酸菌的数量均小于104cfu/g FW，不能满足青贮发酵的最低需求。因此在西藏进行青贮饲料生产时，仅靠材料上附着的乳酸菌进行乳酸发酵，来获得优质青贮饲料较为困难。这样，分离青贮饲料中生长迅速、耐酸能力强的优良乳酸菌菌株显得尤为重要。

图1 乳酸菌菌株LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3和LA3及相关菌种进化树Fig.1 Phylogenetic tree showing the relative positions of strains LCG9，CG35，AG11，LAG1，LCG3，LA3 and related species as inferred by the neighbor-joining method with 16S rRNA gene sequences

在自然青贮过程中，环境温度是影响乳酸菌活性的重要因素[12]。Cao等[13]在对不同季节的发酵TMR进行研究后发现，冬季的低温条件限制了乳酸发酵。青藏高原具有海拔高，气温低，昼夜温差大等气候特点，可能会抑制商品乳酸菌的生长及活性的发挥。Liu等[14]研究发现：商品乳酸菌在20℃条件下生长活性会受到影响，不能很好地发挥作用。但本研究所分离得到的6株乳酸菌均具有较强的耐低温特性，能够在5℃条件下生长，在10℃时生长旺盛；其中LCG9，CG35，LCG3和LA3的耐低温能力较强，在5℃条件下仍生长旺盛。体现了高寒环境分离的乳酸菌对低温条件具有强的适应特性。

表5 分离出的乳酸菌菌株16S rRNA基因序列分析

图2 乳酸菌的酸产生速率Fig.2 Acid-production rate of lactic acid bacteria

图3 乳酸菌的生长曲线Fig.3 Growth curve of lactic acid bacteria

McDonald等[8]归纳总结了作为理想的青贮接种菌必须满足的条件为：1)生长旺盛，能够竞争植物本身所附着的各种菌群；2)为同型发酵乳酸菌，能在尽量短的时间内产生大量乳酸；3)耐酸，能迅速降低pH值，4)可广泛地利用各种可溶性糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖，尤其是戊糖等。本试验所分离得到的6株乳酸菌菌株均为同型发酵乳酸菌；生长速度快、产酸能力强，能迅速降低pH值；具有较强的耐酸特性，能够在pH 3.0条件下生长，pH 3.5时生长旺盛；均满足理想青贮接种剂的条件。其中LCG3和LAG1的产酸能力最强，但由于LAG1在5℃条件下生长微弱，而LCG3生长旺盛，因此LCG3最适宜于用作西藏地区青贮饲料生产用乳酸菌添加剂菌种。但其余乳酸菌菌株在10℃条件下生长能力强，培养48 h后培养液pH均降至4.0以下，OD值达到2.2左右，同样具有制备乳酸菌添加剂的潜质。

根据16S rRNA序列分析和系统进化树，LCG9，CG35和AG11被准确地鉴定为戊糖片球菌；LA3为弯曲乳杆菌。由图1可知：LAG1和LCG3与植物乳杆菌和戊糖乳杆菌处于同一族群，且进化亲缘度为100%；其中LCG3与植物乳杆菌，戊糖乳杆菌的序列相似性分别为100.0%和99.9%；LAG1分别为99.9%和99.8%。许多研究结果表明[15-18]：植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的16S rRNA序列只有2 bp的差别，表现出很高的序列相似性，故无法确定种族。结合伯杰氏细菌鉴定手册和其他研究结果[19]：戊糖乳杆菌可以利用L-阿拉伯糖，D-木糖和鼠李糖产酸，植物乳杆菌不利用鼠李糖产酸；Ennahar等[16]曾指出：植物乳杆菌能够利用松三糖，D-棉籽糖和α-甲基-D-甘露糖苷发酵产酸，但戊糖乳杆菌不能。LCG3和LAG1能利用松三糖，D-棉籽糖，α-甲基-D-甘露糖苷和L-阿拉伯糖发酵产酸，但不利用鼠李糖和D-木糖，故被准确地鉴定为植物乳杆菌。

本试验分离得到的植物乳杆菌、戊糖片球菌和弯曲乳杆菌均为青贮用常见乳酸菌菌种，这为制备优良的青贮饲料添加剂提供了可能。对于分离所得的乳酸菌菌株能否很好地作为西藏及其他低温地区青贮用乳酸菌添加剂以及如何确定添加剂量，还需要在后续试验中做进一步的研究。

4 结论

本研究从西藏地区豆科牧草青贮饲料中分离得到6株优良乳酸菌菌株。经过糖发酵试验和16S rRNA序列分析，3株为戊糖片球菌，2株为植物乳杆菌，1株为弯曲乳杆菌。6株乳酸菌菌株均为同型发酵乳酸菌，具有耐低温，耐酸碱，强的耐盐特性，其中植物乳杆菌LCG3产酸能力最强，发酵速度最快，最适宜于用作青藏高原青贮饲料生产用乳酸菌添加剂。

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Isolation and identification of low temperature-tolerant lactic acid bacteria from legume silages in Tibet

YANG Xiao-Dan1, YUAN Xian-Jun1, GUO Gang1,2, CUI Zhao-Ming1, LI Jun-Feng1, BAI Xi1, BA Sang3, SHAO Tao1*

1.InstituteofEnsilingandProcessingofGrass,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 3.ThePrairieWorkstationofShigatse,Tibet,Rikze857000,China

The objectives of this study were to identify lactic acid bacteria with desirable attributes by isolating and identifying lactic acid bacteria (LAB) from legume silages in Tibetan Plateau. A total of 6 homofermentiative lactic acid bacteria were isolated from alfalfa (Medicagosativa) and common vetch (Viciasativa) silage. Strains LCG9, CG35 and AG11 were identified asPediococcuspentosaceus, strains LCG3 and LAG1 asLactobacillusplantarumand strain LA3 asLactobacilluscurvatu. Conventional microbial identification methods and 16S rRNA sequencing analyses were used to identify different strains. The selected strains were grown in a range of conditions; temperature 5-20℃, pH 3.0-8.0 and NaCl 3.0% and 6.5%. LCG9 and AG11 grew weakly at 5℃ while LCG9 and AG11 were inactive at pH 3.0 and pH 8.0. LCG3 was identified as the best strain to use as a silage additive in Tibet due to its unique tolerance of low temperature, high lactic acid production and rapid reproductive rate.

Legume grass; silage; lactic acid bacteria; isolation; identification

10.11686/cyxb2014312

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-07-14；改回日期：2014-10-21

中国科学院科技服务网络计划(STS计划)(KFJ-EW-STS-071)，国家星火计划项目课题(2013GA840003)，“十二五”国家科技支撑计划(2011BAC09B03)和农业部成果转化项目(2013GB2F40046)资助。

杨晓丹(1990-)，女，河南洛阳人，在读硕士。E-mail: yxd695114957@163.com *通讯作者Corresponding author. E-mail: taoshaolan@163.com

杨晓丹, 原现军, 郭刚, 崔棹茗, 李君风, 白晰, 巴桑, 邵涛. 西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选. 草业学报, 2015, 24(6): 99-107.

Yang X D, Yuan X J, Guo G, Cui Z M, Li J F, Bai X, Ba S, Shao T. Isolation and identification of low temperature-tolerant lactic acid bacteria from legume silages in Tibet. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 99-107.