兔半月板纤维软骨细胞的体外去分化研究

付维力 李箭 李棋 唐新 陈刚

四川大学华西医院骨科（成都610041）

种子细胞是组织工程半月板和细胞治疗的首要因素， 也是保证组织工程半月板进一步深入研究和应用的前提条件[1]。构建组织工程半月板和细胞治疗需要大量的种子细胞， 目前用于组织工程半月板的种子细胞主要有半月板软骨细胞、干细胞等[2]；干细胞如骨髓间充质干细胞具有多项分化潜能，其细胞来源充足、取材方便、分离培养相对简单，但其细胞因子调控和诱导十分复杂并且具有潜在的癌变可能。 自体半月板纤维软骨细胞是目前种子细胞最佳和应用最广泛的细胞来源，而分离的原代细胞培养无法满足细胞数目的要求，单层培养半月板纤维软骨细胞是目前用于半月板细胞扩增的最常用手段， 但是在体外单层培养系统中细胞表型可能会出现改变[3]。近年来的研究已确定体外单层培养系统中关节软骨和椎间盘软骨细胞表型随传代的进行变为成纤维细胞的表型，表现出去分化的现象[4-6]。但目前对半月板细胞体内外生物学特性的认识非常有限， 在单层培养系统中半月板纤维软骨细胞的表型改变尚不确切[7]。本研究采用机械分离与酶连续消化相结合的方法体外分离培养兔半月板纤维软骨细胞， 单层培养传代至第5 代，并从形态学、生长状况、基质蛋白表达水平比较分析体外培养的半月板细胞生物学特性的改变， 为构建组织工程半月板和细胞治疗中的种子细胞优选提供进一步的理论和实践基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

实验动物：清洁级健康1 周龄新西兰乳兔，雌雄不限，体重约200～300 g,由四川大学华西动物实验中心提供。 1∶1 的DMEM/ F12（DF）、FBS、透明质酸酶、胰蛋白酶、EDTA、Ⅱ型胶原酶、MTT、DMSO(Sigma 公司，美国)，PBS （成都新川化学试剂有限公司），CO2培养箱（SANYO 公司，日本）；离心机（Eppendorf 公司，德国），倒置相差显微镜 （Olympus 公司， 日本）， 扫描电镜（JSM-6700F, JEOL, 日本）, 鼠抗兔Ⅰ型胶原单克隆抗体、鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体原（Oncogene 公司，美国），SABC 免疫组化试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司），DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），酶联免疫检测仪(BIORAD，美国)。

1.2 半月板纤维软骨细胞的分离培养、传代

无菌条件下取1 周龄新西兰乳兔双膝内外侧半月板, 尽量切除附着的滑膜和韧带，并切除滑膜缘少量半月板组织，放入盛有DF 培养基的培养皿中，用含1%庆大霉素的PBS 冲洗3 遍, 剪成约1 mm3碎块, 然后0.05%透明质酸酶5min 和0.25%胰蛋白酶37 ℃预消化30 min， 再加入0.2%Ⅱ型胶原酶37 ℃恒温水浴摇床振荡消化4～6 h。 经显微镜观察，大部分细胞消化下来后用巴氏吸管吹打2 min，终止消化，用200 目筛网过滤消化后的细胞悬液，1.2 kpm 离心5 min， 弃上清，PBS 洗两次，加入含10% FBS 的DF, 苔盼蓝染色测定细胞成活率约90%， 细胞计数后细胞按1×106/瓶重悬于含10%FBS 的DF 培养基的25 cm2的培养瓶, 置于37 ℃、5%CO2、95%湿度培养箱中培养。 每3 d 换液1次, 隔日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。 待细胞铺满瓶底（80%～90%融合）后, 吸除培养液， 用含0.1% EDTA 的0.25% 胰蛋白酶消化传代, 倒置相差显微镜下见细胞突触收缩、细胞收缩变圆、细胞间隙增大后吸除消化酶，37 ℃孵育1～2 min。 细胞从瓶壁上脱落后， 加含10% FBS 的DF 培养液吹打混悬终止消化，将细胞悬液按1∶2 比例传代，于37 ℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，每隔2 d 换液。 随即传代至第5 代。 每代细胞悬液按4×104/孔的细胞密度、3 ml 培养液/孔接种于放有24 × 24 血盖片的六孔板上， 隔日观察换液，待细胞长满瓶底取爬片备用。

1.3 形态学观察

在倒置显微镜下隔日观察原代至第5 代细胞的大体形态和生长状况。取第1 代、第5 代细胞爬片行SEM观察：经2.5%戊二醛固定2 h，酒精梯度脱水，醋酸异戊酯固定置换，CO2临界点干燥，表面喷金后于SEM 下观察。

1.4 MTT 法检测细胞增殖，绘制细胞的生长曲线

取第1～5 代半月板纤维软骨细胞，分别以含0.1%EDTA 的0.25% 胰蛋白酶消化后，1.2 kpm 离心5 min后收集，加入10% FBS 的DF 培养基，制备密度为2 ×104个/ ml 的细胞悬液， 以每孔200 μl 接种于96 孔板内，8 孔为1 组，每代细胞各设5 组，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，分别于接种后1、3、5、7、9 d 检测，检测时每孔加入20 μl MTT 液后37 ℃条件下继续培养4 h，吸除全部液体， 每孔加入50 μl DMSO 振荡10 min 至结晶完全溶解，以空白对照孔调零，在酶标仪上检测在570 nm 波长处的吸光度（A）值。 以时间为横坐标、A 值为纵坐标绘制细胞生长曲线， 比较不同代次细胞的生长周期及生长速度。

1.5 细胞化学和免疫组织化学染色

取原代至第5 代半月板细胞爬片行甲苯胺蓝、番红O 染色，免疫组化鉴定细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达情况。

2 结果

2.1 形态学观察

半月板纤维软骨细胞原代接种细胞为小圆球形,呈悬浮状态，接种后8～12 h 开始贴壁, 48～72 h 大部分细胞贴壁完全, 胞质逐渐展开，胞体变大伸长，形成突起，呈多角形。随着细胞数量增加，细胞形态规则，轮廓清晰，光滑，胞浆丰富、透亮，折光性强，镜下观察有立体感，胞核清晰可见，居中，呈圆形/椭圆形，有多个核仁。 接种5 d 后细胞逐渐融合，7～9 d 后，细胞铺满瓶底传代。 传代后细胞贴壁生长能力和增殖速度明显加快，4～6 h 开始贴壁，24 h 贴壁完全，细胞增殖较快，48 h 后开始增殖分裂， 进入对数生长期，4～6 d 后细胞融合成片状，出现接触性抑制。 同时，细胞形成单层、成簇生长，出现明显的聚集样分区，表现出“细胞群集”现象。原代至第2 代半月板软骨细胞生长迅速，形态较规则，多呈多角形，大小均一，细胞周围可见具有折光性的细胞外基质。 细胞传至第3 代后，细胞生长缓慢，不规则细胞逐渐增多， 细胞体积逐渐变大， 形态逐渐变为梭形，出现大量的长梭形细胞，呈漩涡状紧密排列，具有成纤维样细胞的典型特征。随着传代次数的增加，细胞活力逐渐下降，生长速度减慢，传代周期延长，并出现不规则形态的细胞。 第5 代细胞分裂相少见， 密度稀疏，细胞形态不佳，胞浆内出现空泡和黑色小颗粒，胞核散大，细胞间连接松散，细胞增殖普遍减缓、停滞。 随着传代次数的增加, 细胞中梭形细胞增多,第5 代培养细胞大约80%呈长梭形，分泌和增殖能力下降。 见图1。

SEM 观察： 第一代半月板细胞形态规则， 呈多极性，表面有突起，立体感强；第5 代细胞胞体变大，形态不规则。 见图2。

图1 各代次半月板细胞的形态学观察（倒置相差显微镜，×200）

图2 第1、5 代半月板细胞扫描电镜观察（×400）

2.2 细胞生长曲线

生长曲线（图3）可见第4 代前半月板细胞生长速度及生长周期均相似，第5 代后细胞生长速度减慢，增殖减缓。

图3 前5 代半月板细胞生长曲线

2.3 细胞化学和免疫组化染色（图4）

甲苯胺蓝染色：细胞爬片经甲苯胺蓝染色后，细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色，清晰可见1～3 个核仁。 细胞外基质为浅蓝色。3 代以后的软骨细胞逐渐发生去分化，细胞体积增大，出现许多指状突起，胞核增大， 随着传代次数增多， 细胞的甲苯胺蓝染色逐渐变浅。

番红O 染色：番红O 染色主要是对软骨细胞的蛋白聚糖染色，软骨细胞胞内、胞外含大量蛋白聚糖阳性物质被染成红色，软骨细胞被包埋于其中，表明有软骨细胞细胞外基质蛋白聚糖分泌。 随着传代的进行，蛋白聚糖表达逐渐减弱。

免疫组化：表达呈阳性反应为细胞胞浆呈棕黄色，苏木素衬染的细胞核呈蓝色。 Ⅰ型胶原免疫组化染色可见：至第5 代细胞胞浆内阳性反应增强。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，软骨细胞胞浆被染成棕黄色，细胞相互接触少的地方棕色较淡， 细胞密集生长的地方棕色较深，并且细胞外也可见到棕色。 说明在培养的软骨细胞和细胞外基质中有Ⅱ型胶原表达， 即可以从细胞中分泌Ⅱ型胶原到细胞外基质， 说明培养的细胞具有软骨细胞的特征。 第1 代后细胞胞浆内显色明显减弱，且阳性率逐渐降低。

图4 各代次半月板细胞的细胞化学和免疫组化染色（×200）

3 讨论

如何选择理想的半月板组织工程种子细胞目前仍存在争议。 目前用于组织工程半月板的种子细胞主要有自体半月板软骨细胞、干细胞及转基因细胞等[8,9]。干细胞如骨髓间充质干细胞具有多项分化潜能， 其细胞来源充足方便、可以大量扩增、分离培养相对简单，但需要细胞因子刺激诱导转化为纤维软骨细胞或是在修复过程中首先形成纤维组织再转变为纤维软骨, 而细胞因子调控十分复杂，目前对于细胞因子的类型、剂量及其作用机理尚不十分清楚,并具有潜在的癌变可能[10]。 胚胎干细胞具有主动性和无限增殖的能力， 有望成为组织工程半月板种子细胞的新来源， 其应用于临床的最大问题在于如何有效地诱导其向纤维软骨细胞定向分化、有效地建立起无免疫原性的胚胎干细胞系、伦理道德方面观念的制约、致瘤性等。自体半月板纤维软骨细胞是目前种子细胞最佳和应用最广泛的细胞来源[11,12]，而分离的原代细胞培养无法满足细胞数目的要求，单层培养半月板纤维软骨细胞是目前用于半月板细胞扩增最常用的手段， 要扩增到理想的细胞数需要多次传代,但是在体外单层培养系统中细胞表型可能会出现改变。本研究直接从切除的半月板获取纤维软骨细胞, 比较研究不同代次间半月板纤维软骨细胞基质蛋白表达水平和生物学特性的改变， 为构建组织工程半月板和细胞治疗中的种子细胞优选提供了进一步的理论和实践基础。 如何使用适当的条件作用以促进半月板纤维软骨细胞有效增殖并维持其表型特征尚需进一步研究。

半月板由半月板细胞和大量的基质构成， 半月板细胞包埋于基质中。半月板细胞外基质包括蛋白多糖，组成胞外大分子结构如纤连蛋白和层粘连蛋白的I、III型胶原，软骨基质的II 型胶原[13]。对于将半月板细胞归类于软骨细胞还是成纤维细胞，一直存在争议。 有研究发现半月板组织包含成纤维细胞样细胞和软骨细胞两种细胞亚型， 因此认为将其称为纤维软骨细胞较为合适。形态学上，半月板细胞在单层培养条件下显示三种不同的细胞类型[14]：伸长的成纤维细胞样细胞、多边形细胞和小圆的软骨细胞样细胞。McDevitt 等[14]根据半月板细胞形态、 分布和细胞外基质的不同将半月板细胞分为不同的细胞亚群：纤维软骨细胞、成纤维细胞样细胞和位于浅表层区的细胞。 纤维软骨细胞位于半月板内侧2/3 和深部， 呈圆形或椭圆形， 有活跃的分泌功能，细胞外基质主要为Ⅰ、Ⅱ型胶原，其比例为2∶3，提供半月板的支架结构和拉伸性能[15]，还包括蛋白多糖（半月板主要的蛋白多糖是蛋白聚糖，提供压缩性能）；成纤维细胞样细胞位于外周1/3，该区域含少量细胞外基质，主要为Ⅰ型胶原[16]。 Upton 等[17]利用Real-Time PCR 分子技术研究成年猪半月板组织不同区域ECM蛋白基因表达和鉴定短期（3d）单层培养是否能维持该表型，结果发现：半月板内侧有类似于关节软骨基质蛋白高水平的mRNA 表达， 包括蛋白聚糖，II 型胶原和NOS-2； 而外侧含有与纤维组织相关联的蛋白的高水平mRNA 表达， 包括I 型胶 原、 蛋白酶 MMP2 和MMP3；短期单层培养能维持这些表型。 未来的研究将集中于内外侧不同区域基因表达对损伤、 年龄和环境刺激因素的生物学改变的意义。 Verdonk 等[18]在不同条件下培养人半月板细胞，并用FCM 分析细胞外基质的合成产量和半月板细胞膜标记的表型鉴定，结果发现：单层培养条件下细胞外基质包含较多的Ⅰ、 Ⅱ型胶原和较低的蛋白聚糖，而在海藻酸钠微珠（水凝胶）条件下培养包含较高的Ⅰ型胶原和蛋白聚糖， 较低的Ⅱ型胶原； 大部分半月板细胞膜标记CD44+CD105+CD34-CD31-，少部分细胞CD34+CD31-主要来源于外周缘半月板有血管区。 但是这些细胞群准确的细胞表型标记尚不很清楚。

本研究结果显示，体外单层培养条件下，随着传代的进行，半月板纤维软骨细胞活力逐渐下降，生长速度减慢，传代周期延长，逐渐变为梭形，形态不规则。体外单层培养系统中， 半月板纤维软骨细胞表型随传代的进行， Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达逐渐减少而Ⅰ型胶原表达逐渐增多， 体外单层培养条件下培养的半月板纤维软骨细胞在第5 代开始逐渐失去其特异性表型，发生去分化，逐渐变为成纤维细胞的表型。 体外单层分离培养的第5 代前的半月板细胞基本维持纤维软骨细胞的表型和生物学特性， 可作为组织工程半月板的种子细胞。

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