浸润性乳腺癌、乳腺良性病变及正常乳腺组织中骨桥蛋白及相关因子的表达差异及相关性研究

杜正文，高迎飞，王玉明，李新秋，杨 梁

（湖北医药学院附属人民医院甲状腺乳腺血管外科，湖北 十堰 442000）

浸润性乳腺癌、乳腺良性病变及正常乳腺组织中骨桥蛋白及相关因子的表达差异及相关性研究

杜正文，高迎飞，王玉明，李新秋，杨 梁

（湖北医药学院附属人民医院甲状腺乳腺血管外科，湖北 十堰 442000）

目的 检测不同性质乳腺组织中骨桥蛋白(OPN)、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和乳腺肿瘤激酶(Brk)表达量的差异并探讨其临床意义。方法采用免疫组织化学染色法检测92例浸润性乳腺癌组织、60例乳腺良性病变组织和35例正常乳腺组织中OPN、VEGF-C和Brk的表达情况，比较分析其与临床病理学因素之间的相关性。结果三种蛋白OPN、VEGF-C和Brk在浸润性乳腺癌组织中均呈现出较高的表达，阳性表达率分别为66.3%、56.5%和70.7%，与乳腺良性病变以及正常乳腺组织比较差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)。OPN、Brk表达与患者年龄、肿瘤直径以及组织病理学分级无关(P＞0.05)，而与淋巴结转移及TNM分期有关(P＜0.05)；而VEGF-C表达与患者年龄、肿瘤直径无关(P＞0.05)，与组织病理学分级、淋巴结转移及TNM分期有关(P＜0.05)。乳腺癌组织中的OPN、VEGF-C和Brk表达两两之间呈正相关性(P＜0.05)，而在正常乳腺组织和良性病变组织中三者之间无明显相关性(P＞0.05)。结论在正常乳腺组织、良性病变组织和乳腺癌组织中，OPN、Brk与VEGF-C的表达量均依次升高。OPN可能通过介导VEGF-C蛋白刺激内皮细胞黏附和迁移而加速血管形成，通过参与新血管生成和肿瘤的侵袭进而与淋巴结转移有关，三者的表达量均与肿瘤分期、淋巴结转移等临床病理因素有不同程度的相关。

乳腺肿瘤；骨桥蛋白；血管内皮生长因子C；免疫组织化学

乳腺癌(Mammary cancer)是女性中最常见的高发性恶性肿瘤，通常发生于乳房腺上皮组织右上象限，其发病率约占各种恶性肿瘤的10%，已成为威胁妇女健康的主要病因，受到全球医学界的广泛关注。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种与恶性转化相关的蛋白，最早发现于牙齿和骨基质中，是细胞在骨基质中的产物，具有骨特异性，因其是细胞在骨基质中的产物，并能在骨组织细胞与基质中的矿质形成一种桥连，人们将其命名为OPN[2-3]。乳腺肿瘤血管生成一直被认为在肿瘤生长，存活以及转移的过程中起到至关重要的作用。大量研究证明，血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)是最为典型的促血管生成影响因素。研究发现，OPN可能通过乳腺肿瘤激酶(Breast tumor kinase，Brk)、VEGF-C蛋白刺激内皮细胞附着和迁移而作用于肿瘤血管生成，并与肿瘤的侵袭和转移相关。本研究采用免疫组化SP方法，对OPN、Brk和VEGF-C三种肿瘤相关蛋白分别在乳腺癌、良性病变及正常乳腺组织中表达量的差异情况进行对比研究并分析这些蛋白与临床病理学因素之间是否存在相关性，进而探讨OPN、Brk和VEGF-C三种蛋白在浸润性乳腺癌发生与发展过程中所起的作用[4]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院乳腺外科2011年1月至2013年12月92例浸润性乳腺癌手术切除组织，60例良性病变组织和35例正常乳腺组织。乳腺癌患者包括浸润性小叶癌19例，浸润性导管癌73例；年龄25～71岁，平均46岁。所有患者术前均无化疗或放疗史及其他手术史。

1.2 试剂 小鼠抗人OPN单克隆抗体、小鼠抗人VEGF-C单克隆抗体、兔抗人Brk多克隆抗体(均购自美国Santa Cruz公司)；SP免疫组织化学试剂盒(购自中国福州迈新公司)。

1.3 方法 采用免疫组织化学SP(Streptavidin-peroxidase)法检测，切除的组织标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm连续切片4片行免疫组化染色(OPN与VEGF-C蛋白各两片)。步骤如下，二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次×5 min；3%H2O2(80%甲醇)室温处理切片15 min，PBS洗3次×5 min；抗原修复，PBS洗3次×5 min；10%山羊血清封闭液室温封闭孵育30 min；弃封闭液后抗体孵育：按工作浓度加相应一抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗3次×5 min；滴加SP复合物，在37℃恒温箱孵育30 min，PBS洗3次×5 min；新鲜配制的DAB-H2O2显色液孵育5～10 min，在显微镜下观察判断好染色程度；自来水冲洗5 min后用苏木精复染2 min，盐酸酒精分化，自来水再冲洗5～10 min，脱水，透明，封片，显微镜下观察。

1.4 结果判定 OPN、Brk和VEGF-C蛋白阳性表达均定位于细胞浆呈淡黄或棕黄色弥散性染色，每张组织标本切片随机选取5个高倍镜下视野(×400)，分别计算各自的阳性表达细胞百分比，阳性细胞数＜10%者计为阴性结果，≥10%者计为阳性结果。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行数据处理。阳性表达率各组间的比较采用χ2检验；相关性检测用Spearman相关检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在良、恶性及正常乳腺组织中的表达情况 OPN、Brk和VEGF-C蛋白阳性表达均为弥散性细胞浆染色。乳腺癌组织、乳腺良性病变组织及正常乳腺组织中OPN、Brk和VEGF-C蛋白的阳性表达率均呈依次降低，各蛋白三组间同时比较，差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在不同乳腺(病变)组织中的表达

2.2 浸润性乳腺癌组织中的OPN、Brk和VEGF-C表达与临床病理因素的关系 在乳腺癌组织中，OPN和Brk的表达量与患者的年龄、肿瘤直径大小及组织学分级无关(P＞0.05)，仅与淋巴结转移及TNM分期有关(P＜0.05)，并且表达水平与TNM分期呈正相关，即表达水平越高，TNM分期越晚；而VEGF-C蛋白表达与患者的年龄及肿瘤直径大小无关(P＞0.05)，与组织学分级、淋巴结转移及TNM分期相关(P＜0.05)，见表2。

2.3 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在不同组织中表达的相关性分析 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在乳腺癌组织中的表达两两呈正相关(P＜0.05)，而在乳腺良性病变组织和正常乳腺组织中的表达则无明显相关性(P＞0.05)，见表3。

表2 浸润性乳腺癌组织中OPN、VEGF-C及Brk阳性表达与临床病理学因素的相关性

表3 乳腺癌组织中VEGF-C表达和临床病理因素间的相关性

3 讨论

肿瘤细胞的扩散与转移是引起乳腺癌死亡的主要原因，乳腺癌一旦发生转移，则会导致患者的生存机率明显降低。因此，提高浸润性乳腺癌患者治愈率和生存率的主要路径就是减少肿瘤细胞的扩散与转移。相关研究表明，OPN蛋白具备明显促进肿瘤恶化倾向的能力，在一些领域内被认定为恶性肿瘤生长的标志。OPN蛋白在组织中不同水平的表达与机体的反应显著相关，尤其对于感染和创伤的反应方面，在长期的临场实践中也证实了OPN与胃癌、前列腺癌、动脉粥样硬化斑块形成等病理过程密切相关。值得注意的是，OPN蛋白甚至可以全程参与肿瘤的发生发展的过程，在肿瘤细胞转移过程中发挥着不可替代的作用，OPN在机体中的阳性表达已经成为确定肿瘤转移的一个“金标准”，肿瘤转移患者血清中通常可检出OPN蛋白水平明显增高[5]。与前人的研究结果一致，我们的研究结果揭示了OPN在不同组织间表达相差较大：在浸润性乳腺癌组织中表达较高，而在乳腺良性病变组织以及正常乳腺组织细胞中表达较少，提示OPN蛋白参与到了浸润性乳腺癌淋巴管生成以及淋巴结转移的过程。

淋巴系统转移是乳腺癌转移过程中最常见的转移方式。OPN、VEGF、Brk三种蛋白在肿瘤组织发生发展中所扮演的角色尚不确切，近期研究表明，OPN主要参与肿瘤组织微小血管的生成过程，可能借助VEGF、Brk的生理作用刺激内皮细胞粘附和转移而加速新血管形成，从而促进肿瘤组织随着新生血管侵袭和转移。近年来发现的VEGF-C蛋白，作为VEGF基因家族的“明星”蛋白，更多的研究者在关注VEGF-C蛋白，因为其在肿瘤转移过程发挥关键性作用，可促进新的血管和淋巴管生成，极大改变淋巴管管壁的通透性，为肿瘤组织侵袭提供了有利的微环境，因此VEGF-C在乳腺癌淋巴系统转移中发挥至关重要的作用[6]。我们的研究结果表明VEGF-C仅在浸润性乳腺癌组织中表达较高，而在乳腺良性病变组织以及正常乳腺组织细胞中仅少量表达甚至几乎不表达，这说明VEGF-C蛋白在浸润性乳癌的形成中发挥了不可忽视的作用。值得一提的是，国内外相关研究与我们的结果也相符，洪勇等[7]检测三阴性和非三阴性乳腺癌组织中VEGF-C的表达量情况，发现VEGF-C在这两种乳腺癌中均呈阳性表达，其表达率均显著高于良性乳腺病变组织和正常乳腺组织，具有统计学意义；Kinoshita等[8]发现乳腺癌组织中VEGF-C蛋白阳性表达与癌组织淋巴管浸润显著相关，且检出VEGF-C阳性患者5年RFS指标均低于VEFG-C蛋白表达阴性的患者；Nakamura等[9]进一步研究发现，VEGF-C蛋白在乳腺癌组织中的表达与淋巴管密度及淋巴结转移数目有相关性。而沉默VEGF-C基因的表达对肿瘤生长与转移具有消极作用，会导致乳腺癌细胞的侵袭能力、肿瘤的生长速度、淋巴管生成及淋巴系统转移率等不同程度的降低[10]。研究表明，VEGF-C蛋白的表达水平与行新辅助化疗患者的预后密切相关，可作为晚期乳腺癌患者行新辅助化疗后的愈后预测因素[11-12]。Garmy-Susini等[13]发现VEGF-C可以通过整合素α4β1激活淋巴管内皮细胞或其受体来促进肿瘤的淋巴结转移，但其具体的作用机制尚不明确。近年研究发现生存素及细胞外基质蛋白1(ECM1)与VEGF-C在乳腺癌组织中的表达呈正相关，共同表达于乳腺癌组织[14-15]。VEGF-C的表达和分泌受多种因素，比如炎性因子的调节，但是这些因素对VEGF-C的表达和分泌的机制尚不明了，在将来的研究中，笔者将从炎性细胞因子网络和VEGF-C、OPN以及Brk之间相互作用方面来探讨乳腺癌发生发展的作用机制。此外，基于VEGF-C、OPN以及Brk蛋白，利用rRNA干扰技术或基因敲除技术做进一步的研究和炎症，将对揭示乳腺癌组织浸润和转移提供重要的科研证据。因为研究上述因子之间的调控机制，寻找新的治疗靶点，研究新的治疗方法，积极预防乳腺癌的远处转移，对乳腺癌患者的治疗及延长患者寿命都具有重要的意义。

本文研究结果表明，在浸润性乳腺癌组织中OPN、Brk和VEGF-C蛋白表达之间存在两两相关性(P＜0.05)，说明OPN可能作为上游基因通过影响Brk和VEGF-C等或其受体参与肿瘤，尤其是乳腺肿瘤的发生和转移，而在良性乳腺病变组织和正常乳腺组织中OPN、Brk和VEGF-C表达之间则没有体现出相关性(P＞0.05)，也从侧面说明了OPN对于肿瘤发生与转移的具体涵义，但具体的机制有待进一步的研究。此外我们发现，三者在乳腺癌组织、乳腺良性病变组织和正常乳腺组织中表达阳性率的逐级递减的规律，即在癌组织中高表达，在正常组织几乎不表达，这种变化趋势也证实了这些因素在乳腺癌发生、发展中起到了至关重要的作用，且与浸润性乳腺癌的侵袭性呈正相关，以此可探索新的诊断乳腺癌，尤其是乳腺癌是否有淋巴管转移的重要标准，也可作为判断乳腺癌预后的重要指标。

[1]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics for Hispanics/ Latinos,2012[J].CACancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[2]Lin F,Li Y,Cao J,et al.Overexpression of osteopontin in hepatocellular carcinoma and its relationships with metastasis,invasion of tumor cells[J].Mol Biol Rep,2011,38(8):5205-5210.

[3]Mi Z,Bhattacharga SD,Kin VM,et al.Osteopontin promotes CCL5-mesenchymal stromal cell-mediated breast cancer metastasis [J].Carcinogenesis,2011,32(4):477-487.

[4]谷 明,郑新宇.骨桥蛋白及其相关因子在乳腺癌组织中的表达及其临床意义[J].中国普外基础与临床杂志,2013,20(8):890-895.

[5]杨 莉,魏 玲,左文述.骨桥蛋白与乳腺癌的研究现状[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(14):1133-1137.

[6]王 征,王永霞.骨桥蛋白和血管内皮生长因子-C蛋白在浸润性乳腺癌组织中的表达及意义 [J].广东医学,2013,34(12): 1901-1903.

[7]洪 勇,范 平,邱超学,等.三阴性、非三阴性乳腺癌中血管内皮生长因子-C的表达及临床意义[J].实用医学杂志,2012,28(14): 2306-2308.

[8]Kinoshita J,Kitamura K,Kabashima A,et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C)in breast cancer [J].Breast Cancer Res Treat,2001,6(2):159-164.

[9]Nakamura Y,Yasuoka H,Tsujimoto M,et al.Lymph vessel density correlates with nodal status,VEGF-C expression,and prognosis in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2005,91(2):125-132.

[10]Guo B,Zhang Y,Lou G,et al.Lentivirus-mediated small interfering RNA targeting VEGF-C inhibited tumor lymphangiogenesis and growth in breast carcinoma[J].Anat Rec(Hoboken),2009,292(5): 633-639.

[11]Brito LG,Schiavon VF,Andrade JM,et al.Expression of Hypoxia-inducible factor 1-α and Vascular endothelial growth factor-C in locally advanced breast cancer patients[J].Clinics(Sao Paulo), 2011,66(8):1313-1320.

[12]Wang J,Guo Y,Wang B,et al.Lymphatic microvessel density and vascular endothelial growth factor-C and-D as prognostic factors in breast cancer:a systematic review and meta-analysis of the literature[J].Mol Biol Rep,2012,39(12):11153-11165.

[13]Garmy-Susini B,Avraamides CJ,Desqrosellier JS,et al.PI3Kα activates integrin α4β1 to establish a metastatic niche in lymph nodes [J].Proc NatlAcad Sci USA,2013,110(22):9042-9047.

[14]Cai X,Ma S,Gu M,et al.Survivin regulates the expression of VEGF-C in lymphatic metastasis of breast cancer[J].Diagn Pathol, 2012,7:52.

[15]Wu QW,She HQ,Liang J,et al.Expression and clinical significance of extracellular matrix protein 1 and vascular endothelial growth factor-C in lymphatic metastasis of human breast cancer[J]. BMC Cancer,2012,12:47.

Differential expression of osteopontin and related factors in invasive breast cancer,benign breast lesion, normal breast tissues and correlation analysis.

DU Zheng-wen,GAO Ying-fei,WANG Yu-ming,LI Xin-qiu,YANG Liang.
Department of Vascular,Thyroid,and Breast Surgery,the People's Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo detect the differential expression of osteopontin(OPN),vascular endothelial growth factor C(VEGF-C)and breast tumor kinase(Brk)in different breast tissue types,and to evaluate its clinical significance.MethodsImmunohistochemical staining was applied to detect the expression of OPN,VEGF-C and Brk in 92 cases of invasive breast cancer,60 cases of benign breast lesions and 35 cases of normal breast tissue. Their correlation with clinicopathological factors were compared and analyzed.ResultsOPN,VEGF-C and Brk proteins in invasive breast cancer all showed high positive expression rates of 66.3%,56.5%and 70.7%,respectively, which had statistically significant difference with those in benign breast lesions and normal breast tissue(P＜0.01). The expressions of OPN,Brk showed no correlation with age,tumor size and histological grade(P＞0.05),but were correlated with lymph node metastasis and TNM stage(P＜0.05).VEGF-C expression were correlated to histopathologic grade,lymph node metastasis and TNM stage(P＜0.05),but not with age,tumor size(P＞0.05).In breast cancer, there was positive correlation between the expression of OPN,VEGF-C and Brk(P＜0.05),no with no significant correlation in normal breast tissue and benign breast lesions(P＞0.05).ConclusionIn normal breast tissue,benign breast lesions and breast cancer,the expression levels of OPN,Brk and VEGF-C increase successively.OPN, through mediating VEGF-C,may stimulate endothelial cell adhesion and migration to accelerate angiogenesis.It is involved in angiogenesis and tumor invasion and thus correlated with lymph node metastasis.The expression levels of OPN,Brk and VEGF-C are correlated to clinical pathological factors of tumor stage,lymph node metastasis to different extents.

Breast cancer;Osteopontin;Vascular endothelial growth factor C;Immunohistochemistry

R737.9

A

1003—6350（2015）06—0806—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0289

2014-08-19)

高迎飞。E-mail：2118wy@126.com