刺五加注射液预处理在大鼠肾缺血再灌注损伤中的抗氧化作用及其对肿瘤坏死因子-α的影响

李 强，靳书滨，陈 晶，王 杰，霍韶军，张瑞刚

(1.邯郸市中心医院泌尿外科，河北 邯郸 056001；2.河北联合大学生命科学学院，河北 唐山 063015)

刺五加注射液预处理在大鼠肾缺血再灌注损伤中的抗氧化作用及其对肿瘤坏死因子-α的影响

李 强1，靳书滨1，陈 晶2，王 杰1，霍韶军1，张瑞刚1

(1.邯郸市中心医院泌尿外科，河北 邯郸 056001；2.河北联合大学生命科学学院，河北 唐山 063015)

目的 探讨刺五加注射液(Aeanthopanax senticosus，AS)预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury，IRI)的保护作用及其机制。方法本实验于2014年3～6月选用36只健康雄性SD大鼠随机分为对照组(Control组)、缺血再灌注组(IRI组)和刺五加注射液组(AS组)，每组12只，三组组内再按5 h、10 h 2个时间点分为两组，共6组，每组6只。采用单动脉夹闭法构建大鼠急性肾IRI模型。Control组术中仅切除右肾，不夹闭左肾动脉，IRI组和AS组切除大鼠右肾，夹闭左侧肾动脉45 min后解除夹闭。AS组于术前5 d及术前0.5 h给予1次AS(100 mg/kg)腹腔注射，Control组及IRI组则给予同等剂量的生理盐水。检测各组大鼠血清肌酐(Scr)、超氧化物岐化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果AS组、IRI组与对照组比较，Scr水平均明显升高(P＜0.05)，血清SOD活性降低，血清MDA、TNF-α水平增加(P＜0.05)。AS组的Scr、MDA、TNF-α均比IRI组低(P＜0.05)，而SOD水平升高(P＜0.05)。结论AS对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能是通过抗氧化、抑制炎症反应作用实现的。

刺五加注射液；肾缺血再灌注损伤；超氧化物歧化酶；丙二醛；肿瘤坏死因子-α

实验表明[1-2]，肾缺血后组织血液再灌注引起的氧化损伤及炎症级联反应是导致损伤的重要因素，其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在其中起着重要的作用。本实验通过成功构建大鼠肾IRI模型，观察AS预处理对大鼠肾IRI后静脉血中TNF-α、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)及血清肌酐(Scr)的影响，以探讨其抗肾IRI的机理。

1 材料与方法

1.1 动物 选用普通级健康SD大鼠36只，8～10周龄，体重210～220 g。实验时动物的饲养和取材严格按照实验动物管理和保护的相关规定进行。

1.2 药品与试剂 刺五加注射液，黑龙江乌苏里江制药厂生产，每支100 ml，含总黄酮300 mg。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-αELISA试剂盒由武汉博士德生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 普通级健康雄性SD大鼠36只，实验分六组，把36只SD大鼠按体重编号后，由随机数字表产生36个随机数字，将其除以6，将动物根据余数的不同平均分在6个组中(Control 5 h组、Control 10 h组、IRI 5 h组、IRI 10 h组、AS 5 h组、AS 10 h组)。

1.3.2 造模方法 采用阻断单一肾动脉法构建大鼠肾IRI模型。术区消毒铺巾，取上腹正中直切口打开腹腔，然后应用肝素盐水2 ml(肝素200 U/ml)注入腹腔，大约10 min后便可致全身肝素化，牵开肠管，打开侧腹膜，探及右侧肾脏，显露并结扎肾蒂后切除右肾，然后分离左肾蒂，显露左肾动、静脉；对照组将肠管复位，关闭腹腔，缝合腹壁，计时45 min后再次开腹，观察左肾，再次关腹并计时，分别于5 h、10 h后取标本。对IRI组及AS组大鼠用无创动脉夹将左肾动脉夹闭，肾脏呈现紫黑色，并记时开始，缝合腹壁，45 min后，再次打开腹腔，松开血管夹恢复血流，并开始记录再灌注时间(各组分别于再灌注5 h、10 h后取血)。如肾脏颜色从黑色逐渐变为红色表明模型建立成功，建模过程见图1，如果5 min后颜色未转变，则造模失败。

图1 建模过程

1.3.3 给药方法 AS组大鼠于术前5 d，每天1次及术前30 min给予AS腹腔注射(按大鼠体重100 mg/kg)；Control、IRI组于相同时间腹腔注射与AS等量的生理盐水。

1.4 检测指标与方法 取各组大鼠血浆离心，取上清，送邯郸市中心医院检验科全自动生化分析仪检测Scr；按试剂盒说明书提供方法检测大鼠血清MDA含量，SOD活性；取大鼠血浆，离心后取上清液，按ELISA试剂盒自带说明书进行血清TNF-α含量的检测。

1.5 统计学方法 实验数据为计量资料，用均数±标准差(±s)表示集中和离散趋势，数据建立EXCEL数据库，采用SPSS16.0统计软件包进行统计学处理。在5 h、10 h两个时间点进行比较(每个时间点有三个组)，每三组之间比较采用单因素方差分析(ANOA)，三组中每两组之间比较采用LSD法；IRI 5 h组和IRI 10 h组之间比较采用t检验。取α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 不同时间点各组大鼠血清Scr水平比较 (1) IRI组、AS组Scr水平与对照组相比明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；(2)AS组Scr水平均低于IRI组，差异有统计学意义(P＜0.05)。(3)IRI 5 h组和IRI 10 h组相比较，IRI 10 h组Scr水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 不同时间点各组大鼠血清Scr水平比较(n=6，±s)

注：a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与IRI组相同时间点比较，P＜0.05；c表示与IRI 5 h组比较，P＜0.05。

组别 例数Scr(µmol/L) Control 5 h组649.31±5.1 Control 10 h组648.43±4.9 IRI 5 h组6157.40±16.78aIRI 10 h组6225.36±19.75acAS 5 h组6105.41±9.69abAS 10 h组6109.41±9.8ab

2.2 不同时间点各组大鼠血清MDA含量和SOD活性比较 (1)IRI组、AS组与对照组相比，血清SOD活性均明显降低，而MDA含量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；(2)IR I 5 h和IRI 10 h组比较，IRI 10 h组血清SOD活性明显降低，MDA含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；(3)AS组大鼠血清中SOD活性比IRI组均明显升高，MDA含量均下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 不同时间点各组大鼠雪晴MDA含量和SOD活性比较（n=6,±s）

表2 不同时间点各组大鼠雪晴MDA含量和SOD活性比较（n=6,±s）

注：a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与IRI组相同时间点比较，P＜0.05；c表示与IRI 5 h组比较，P＜0.05。

组别Control 5 h组Control 10 h组IRI 5 h组IRI 10 h组AS 5 h组AS 10 h组例数6 6 6 6 6 6 SOD(U/mg) 111.6±9.96 127.45±7.35 58.21±6.15a45.62±5.75ac80.34±5.52ab66.89±6.25abMDA(nmol/mg) 9.07±1.14 8.3±1.24 28.35±3.35a42.41±5.33ac15.25±2.15ab13.45±2.01ab

2.3 不同时间点大鼠血清TNF-α水平比较 (1) IRI组、AS组与对照组相比均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；(2)AS组与IRI组相比，TNF-α均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；(3)IRI 10 h和IRI 5 h组比较，IRI 10 h组TNF-α含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 不同时间点各组大鼠血清TNF-α水平比较(n=6，±s)

表3 不同时间点各组大鼠血清TNF-α水平比较(n=6，±s)

注：a表示与对照组比较，P<0.05；b表示与IRI组相同时间点比较，P<0.05；c表示与IRI5h组比较，P<0.05。

组别Control 5 h组Control 10 h组IRI 5 h组IRI 10 h组AS 5 h组AS 10 h组6 6 6 6 6 6 65.48±5.69 74.96±10.40 107.34±10.48a136.08±9.75ac85.95±6.8ab99.02±11.28ab例数TNF-α含量(pg/ml)

3 讨论

自由基的化学性质极为活泼，易于失去电子(氧化)或获得电子(还原)，参与体内的电子转移和物质代谢。生理情况下，细胞存在的抗氧化物质(如SOD等)可及时清除自由基，使自由基的生成与降解处于动态平衡，对机体并无有害影响。肾IRI后，在缺血期组织含氧量减少，作为电子受体的氧不足，再灌注恢复组织氧供应，也提供了大量电子受体，通过黄嘌呤氧化酶等途径，使氧自由基在短时间内爆发性增多，由于活性氧生成过多或机体抗氧化能力不足，可引发氧化应激反应。氧自由基一旦生成，即可经其中间代谢产物不断扩展生成新的自由基，形成连锁反应。自由基可与各种细胞成分，如膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反应，造成细胞结构损伤和功能代谢障碍。自由基引起的脂质过氧化过程中可生成多种醛类产物，其中以对MDA的研究最多。MDA可以作为交联剂促进核酸、蛋白质及磷脂的交联，改变生物大分子的功能。通过检测MDA的含量可以反映脂质过氧化的程度。体内SOD活性增加就会增加对抗氧自由基的作用，使得脂质过氧化反应减少，常将SOD活力的测定与MDA含量的测定相配和。有研究证实刺五加中含有的多种抗氧化剂可通过不同途径发挥作用，显示出多组分协同抗氧化的优势[3-6]。本研究结果显示，AS预处理明显降低了血清MDA含量，增强SOD活性，使Scr水平下降，说明AS对大鼠IRI的肾脏有一定的保护作用，其机制可能与它的有效抗氧化成分有关。

近年来的研究表明，白细胞激活介导的微血管损伤在IRI的发病中起重要作用。IRI可使白细胞聚集和激活，激活的中性粒细胞可释放TNF-α、IL-1和IL-6，引起血管内皮细胞和白细胞表面粘附分子暴露，两者的亲和力增强，结果造成微血管损伤。激活的中性粒细胞与血管内皮细胞可释放大量的致炎物质，使周围组织细胞受到损伤，导致局部炎症反应。有研究发现，肾IRI发生后在TNF-α等细胞因子及活性氧代谢产物刺激下，ICAM-1表达增强，导致中性粒细胞在局部集聚，进而造成器官功能损伤[7-8]。从本实验可以看出，当大鼠遭遇急性肾IRI后血清TNF-α明显增加，而且在损伤后初期的一段时间(5 h、10 h)，TNF-α呈逐渐升高趋势。AS预处理后血清TNF-α、Scr下降，肾功能得到了好转。

由此我们可以推测AS预处理起保护作用的机理可能是其具有抗氧化作用，减轻IRI后对组织的过氧化损伤。起保护作用的另一途径可能是通过抑制其炎症反应的某些环节，使得炎性反应损伤减轻，炎性因子表达减少，或者可能有部分直接抑制TNF-α表达的功能，TNF-α作为重要的炎症始动因子受到抑制，那么由它介导和趋化的相关炎性级联扩大反应损伤就受到抑制，从而减轻肾IRI。然而肾缺血再灌注损伤机制复杂，还需要进一步观察AS预处理对其他炎性因子的影响，探讨其作用机制。

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Effect of aeanthopanax senticosus on antioxidants and serum TNF-α during acute renal ischemia-reperfusion injury in rats.

LI Qiang1,JIN Shu-bin1,CHEN Jing2,Wang Jie1,HUO Shao-jun1,ZHANG Rui-gang1.1.Department of Urology,Handan Central Hospital,Handan 056001,Hebei,CHINA;2.College of Life Sciences,Hebei United University,Tangshan 063015,Hebei,CHINA

Objective To observe the protective effect of aeanthopanax senticosus(AS)and discuss its possible mechanism on rats with acute renal ischemia-reperfusion injury(IRI).MethodsThirty-six healthy male SD rats from Mar.2014 to Jun.2014 were randomly divided into six groups:Control 5 h group(n=6),Control 10 h group(n= 6),IRI 5 h group(n=6),IRI 10 h group(n=6),AS 5 h group(n=6),AS 10 h group(n=6).Rat models with acute renal IRI were constructed by single-artery occlusion.The rats of Control(5 h,10 h)group only had resection of the right kidney.The IRI(5 h,10 h)group and AS(5 h,10 h)group were removed right kidney,and the left renal were occlusived by small vascular clamp for 45 min.AS group rats was injected intraperitoneally 5 days and 30 min before surgery by AS 100 mg/kg;Control group and IRI group were given intraperitoneal injection by saline equivalent as AS group in mean time.The levels of serum creatinine(Scr),superoxide dismutase(SOD),malonaldehyde(MDA),tumor necrosis factorα(TNF-α)were measured.ResultsCompared with the control group,the levels of Scr in IRI group and AS group were significantly elevated(allP＜0.05).SOD activity of serum in IRI group and AS group descended significantly,but MDA and TNF-αcontents increased significantly(allP＜0.05).In AS group,SOD activity of serum was stepped up,but the levels of Scr,MDA and TNF-αdecreased,which showed significant difference compared with IRI group(allP＜0.05).ConclusionAS pretreatment has a protective effect on rats with acute renal IRI,which might be realized by antioxidation and inhibiting inflammatory reaction.

Aeanthopanax senticosus;Renal ischemia reperfusion injury;Superoxide dismutase(SOD); Malonaldehyde(MDA);Tumor necrosis factorα(TNF-α)

R-332

A

1003—6350（2015）07—0941—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0338

2014-09-24)

邯郸市科学技术研究与发展计划项目（编号：1423108062-4）

李 强。E-mail：xinghuoliqiang@163.com