益智不同提取物对水负荷多尿模型大鼠缩尿作用的研究

李永辉，谭银丰，袁贵林，张俊清

(1.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571199；2.海南医学院药学院，海南 海口 571199)

益智不同提取物对水负荷多尿模型大鼠缩尿作用的研究

李永辉1，2，谭银丰1，2，袁贵林2，张俊清1，2

(1.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571199；2.海南医学院药学院，海南 海口 571199)

目的 研究益智7种提取物对大鼠水负荷多尿模型大鼠的缩尿作用，并探讨分析益智缩尿的物质基础。方法采用水负荷多尿模型大鼠，对益智7种提取物进行缩尿活性筛选，采用代谢笼测定大鼠尿量、首次排尿时间，并计算2 h排泄率；ELISA测定大鼠血清中CRH的含量。结果益智醇提物组、益智果仁醇提物组、益智大孔树脂90%洗脱物组和圆柚酮组可以明显的降低2 h大鼠尿量(P＜0.05)，延长大鼠首次排尿时间(P＜0.05)，并能降低血清CRH的含量。结论益智的缩尿活性成分主要存在于益智果仁中，以圆柚酮为代表的倍半萜类成分可能是益智缩尿的物质基础。

益智；缩尿；活性成分；提取物

益智为姜科植物益智(Alpinia oxyphyllaMiq.)的干燥果实，是姜科山姜属的常用中药材，具有温脾止泻摄唾，暖肾固精缩尿的功效，临床上用于治疗虚寒腹泻、遗尿等多种疾病[1-2]。现代药理学研究表明，益智具有抗炎[3]、抗过敏[4]、抗溃疡[5]和神经保护作用[6-8]等多种药理作用。益智的化学成分研究表明，倍半萜、二苯基庚烷和黄酮是益智中的主要成分类别[9-10]。

益智的传统应用多“去壳”使用，如《理伤续断方》记载“去壳炒”，《炮炙大法》“去壳炒，临用研”。《本草蒙筌》“去壳取仁，研碎入药，盐煎。”。清代《本草述钩元》“去壳，或炒或煨，临用研。而在现代临床应用中益智多为全果使用，少见去壳后的益智仁。在我们的前期研究中，发现益智的果壳和果仁中化学成分差异较大，益智的倍半萜成分主要存在于益智果仁中，二苯基庚烷和黄酮类成分主要存在于益智果壳中[11]。因此在前期研究结果的基础上，我们制备了7种益智提取物(成分)，运用水负荷多尿模型大鼠对7种提取物(成分)的缩尿功效进行了研究，以期揭示益智缩尿的物质基础，解释益智传统应用的科学内涵，进而为益智的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠，体质量180～200 g，雄性，由长沙天勤生物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(湘)2009-0012。

1.2 药品与试剂 缩泉丸(湖南汉森制药股份有限公司，批号130102)、益智药材[产地海南琼中，经海南医学院药学院田建平副教授鉴定为姜科植物益智(Alpinia oxyphyllaMiq.)的干燥成熟果实]、促肾上腺皮质激素释放因子(CRH)ELSIA试剂盒(武汉华美生物科技有限公司，批号C0607980317)。

1.3 制备方法 (1)益智挥发油：益智粉碎后加6倍量水，采用水蒸气蒸馏的方法提取挥发油，以吐温80配成相应的给药浓度；(2)益智醇提物：益智粉碎后加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取时间为1 h，减压回收乙醇至无醇味，以吐温80配成相应的给药浓度；(3)益智果壳醇提物：益智粉碎后，以14目分样筛筛选益智果壳，加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取时间为1 h，减压回收乙醇至无醇味，以吐温80配成相应的给药浓度；(4)益智果仁醇提物：益智粉碎后，以14目分样筛筛选益智果仁，加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取时间为1 h，减压回收乙醇至无醇味，以吐温80配成相应的给药浓度；(5)益智大孔树脂乙醇洗脱物：益智粉碎后，以8倍量的95%乙醇回流提取1 h，提取液减压回收至无醇味，以2倍量的50%乙醇溶解，上HP-20大孔吸附树脂，上样2次，先以5倍量的50%乙醇洗脱，减压回收50%乙醇洗脱液至无醇味，以吐温80配成相应的给药浓度，得益智大孔树脂50%乙醇洗脱物，继续以5倍量的90%乙醇洗脱，减压回收90%乙醇洗脱液至无醇味，以吐温80配成相应的给药浓度，得益智大孔树脂90%乙醇洗脱物；(6)圆柚酮：取圆柚酮化合物，以吐温80配成相应的给药浓度。

1.4 方法

1.4.1 动物筛选 SD大鼠，实验前12 h禁食不禁水，仿Aston法对动物进行筛选，即按照体重灌注去离子水22 ml/kg，使动物体内水平衡。收集2 h尿液，尿量超过40%水负荷者为合格。

1.4.2 分组与给药 取筛选合格的大鼠80只，按尿量、体重均匀分为正常组、模型组、缩泉丸组、益智挥发油组、益智醇提取组、益智果壳醇提取组、益智果仁醇提物组、益智大孔树脂50%乙醇洗脱物组、益智90%乙醇洗脱物组、圆柚酮组，每组8只动物。每组按5 ml/kg灌胃给药10 d，正常组和模型组给予等体积的生理盐水，分别于给药前和末次给药1 h后按25 ml/kg灌胃去离子水，正常组不给水负荷，挤尽膀胱余尿，置代谢笼中分别观察给药前和给药后2 h尿量及首次排尿时间。试验结束后，大鼠眼眶静脉丛取血1 ml，分离血清，-80℃保存。缩泉丸给药剂量为3.0 g/kg，益智各组给药剂量为生药7.5 g/kg，圆柚酮给药剂量为60 ml/kg，相当成人日服剂量的50倍。

1.5 统计学方法 采用SPSS12.0软件进行数据分析，尿量的计量数据以均数±标准差(±s)表示，样本组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对尿量的影响 与模型组比较，益智醇提取组、益智果仁醇提物组和圆柚酮组可以显著降低大鼠2 h尿量，益智90%乙醇洗脱物组具有降低大鼠尿量的趋势，见表1。

表1 益智各提取物(成分)对水负荷多尿模型大鼠尿量的影响(±s，n=8)

表1 益智各提取物(成分)对水负荷多尿模型大鼠尿量的影响(±s，n=8)

注：与模型组比较，aP＜0.01，bP＜0.05。

正常组模型组缩泉丸组益智挥发油组益智醇提物组益智果壳醇提物组益智果仁醇提物组益智大孔树脂50%洗脱物组益智大孔树脂90%洗脱物组圆柚酮组----3.0 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 60 mg/kg 0.92±0.68 4.85±1.04 3.92±0.93 5.21±1.13 3.15±0.86a5.05±1.02 3.47±0.83a4.35±1.32 3.48±1.12 3.28±1.06b19.18 -7.42 35.05 -4.12 28.45 10.31 28.25 32.37

2.2 益智各组(成分)对水负荷多尿模型大鼠排尿的影响 与模型组相比，各给药组对大鼠首次排尿时间均有一定的延长，其中益智醇提物组、益智果仁醇提物组、益智大孔树脂90%洗脱物组和圆柚酮组对大鼠首次排尿时间影响较显著(P＜0.05)。大鼠2 h平均尿量排泄率中，益智醇提物组、益智果仁醇提物组、益智大孔树脂90%洗脱物组和圆柚酮组的排泄率均小于70%，显示该4组对大鼠尿量均有较好的“缩尿”作用，见表2。

表2 益智各组（成分）对水负荷多尿模型大鼠排尿的影响(±s，n=8)

表2 益智各组（成分）对水负荷多尿模型大鼠排尿的影响(±s，n=8)

注：与模型组比较，aP＜0.05。

组别 剂量 首次排尿 平均尿量时间(min)排泄率(%正常组-45.13±8.53-模型组-14.85±5.1597.00缩泉丸组3.0 g/kg37.46±9.16a78.40益智挥发油组7.5 g/kg16.32±6.17104.20益智醇提物组7.5 g/kg31.56±5.29a63.00益智果壳醇提物组7.5 g/kg19.62±8.16101.00益智果仁醇提物组7.5 g/kg35.18±6.27a69.40益智大孔树脂50%洗脱物组7.5 g/kg20.43±6.2787.00益智大孔树脂90%洗脱物组7.5 g/kg29.29±5.38a69.60圆柚酮组60 mg/kg26.78±8.12a65.60 )

2.3 益智各组对大鼠血清CRH含量的影响 益智各给药组对血清中CRH均有一定降低趋势，尤其是益智果仁醇提物组和益智醇提物组下降较明显，但是由于整体影响较小，差异均无统计学意义，见表3。

表3 益智各组对大鼠血清CRH含量的影响(±s，n=8)

表3 益智各组对大鼠血清CRH含量的影响(±s，n=8)

组别 剂量CRH(ng/ml)正常组-7.39±0.28模型组-7.24±0.31缩泉丸组3.0 g/kg7.01±0.23益智挥发油组7.5 g/kg7.32±0.18益智醇提物组7.5 g/kg6.32±0.19益智果壳醇提物组7.5 g/kg6.98±0.16益智果仁醇提物组7.5 g/kg6.20±0.23益智大孔树脂50%洗脱物组7.5 g/kg6.98±0.17益智大孔树脂90%洗脱物组7.5 g/kg6.52±0.13圆柚酮组60 mg/kg6.34±0.25

3 讨论

益智果实由果壳和果仁两部分组成，在传统应用中多为“去壳”使用。笔者前期研究发现[11]，益智果壳中主要含有二苯基庚烷和黄酮类化合物，益智果仁中主要含有倍半萜类化合物，结合传统的“去壳”使用，可以推测缩尿的活性物质可能存在于益智果仁中，倍半萜可能是其主要活性成分。大鼠水负荷实验进一步显示，益智果仁提取物的缩尿活性明显优于益智果壳提取物，验证了“益智缩尿的活性成分主要存在于益智果仁中”的假设。结合倍半萜的代表性成分圆柚酮的缩尿实验，发现圆柚酮可以明显的减少大鼠2 h尿量。因此可以基本确定益智中倍半萜类化合物对缩尿功效有较大贡献。

在进行大鼠水负荷实验中，不同大鼠的排尿尿量和排尿时间的个体差异较大，部分大鼠在2 h内不产生排尿。因此在实验前首先要对大鼠进行尿量筛选，选择2 h尿量超过40%水负荷的大鼠进行实验。

促肾上腺皮质激素生成激素是由下丘脑神经元合成，垂体分泌的一种激素。Darcie等[12]研究发现，在大鼠鞘内注射20 μg或腹腔注射20 mg/kg的CRH，可以增加膀胱收缩频率和降低膀胱，进而产生遗尿。本文选择了CRH作为检测指标，对益智各提取物的缩尿机制进行了探讨，其中益智醇提物组、益智果仁醇提物组和益智大孔树脂洗脱90%洗脱物组呈现了较明显的降低血浆CRH的作用，提示益智缩尿与CRH有一定关系。

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Study on the urine reduction of seven extracts of Alpinia oxyphylla in water-loading diuresis model rats.

LI Yong-hui1,2,TAN Yin-feng1,2,YUAN Gui-lin2,ZHANG Jun-qing1,2.1.Hainan Provincial Key Laboratory of Research and Development of Tropical Medicinal Plants,Haikou 571199,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the effect of 7 kinds of extract ofAlpinia oxyphyllaon urine reduction of water-loading diuresis model rats,and to screen the urine reduction bioactive components ofAlpinia oxyphylla.MethodsUsing water-loading diuresis model rats,seven extracts ofAlpinia oxyphyllawere screened for their activity of urine reduction.The metabolism cage was used to determine the urine volume and the excretion time of rats.The 2 h excretion rate was calculated.The CRH content in rat serum was also determined by ELISA.ResultsThe ethanol extract ofA.oxyphylla,the ethanol extract ofA.oxyphyllaseed,the 90%ethanol elution of macroporous resin and nootkatone could significantly reduce the urine volume in 2 h(P＜0.05),prolong the first excretion time(P＜0.05), and decrease the contents of CRH in serum.ConclusionThe urine reduction bioactive components mainly exist inA.oxyphyllaseed,and the sesquiterpene compounds might be the material basis of urine reduction inA.oxyphylla.

Alpinia oxyphylla;Urine reduction;Bioactive components;Extrac

R-332

A

1003—6350（2015）08—1105—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0396

2014-10-09)

海南省自然科学基金(编号：813196)；海南省应用技术研发与示范推广专项(编号：ZDXM2014071)

张俊清。E-mail：jqzhang2011@163.com