中空多孔钛假体复合松质骨基质兔体内骨生成组织学研究

魏均强，蔡 谞，陶 笙，张 莉，赵 斌，汪嫒媛

（1.中国人民解放军总医院海南分院骨科，海南 三亚 572013；2.中国人民解放军总医院骨科，北京 100853）

中空多孔钛假体复合松质骨基质兔体内骨生成组织学研究

魏均强1，蔡 谞2，陶 笙1，张 莉2，赵 斌2，汪嫒媛2

（1.中国人民解放军总医院海南分院骨科，海南 三亚 572013；2.中国人民解放军总医院骨科，北京 100853）

目的 利用复合松质骨基质(Cancellous bone matrix，CBM)的中空多孔钛假体(Hollow porous titanium prostheses,HPTP)观察兔体内假体周围及内部骨生成情况，探讨人工假体与骨质整合的改进方法。方法设计中空多孔(孔径2 mm)和无孔两种假体，表面行羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)喷涂。实验组分为无孔假体组(A组)、HPTP组(B组)和HPTP＋CBM组(C组)，每组16例。将假体分别植入48只4～6个月龄新西兰大白兔右侧股骨外侧髁，饲养至第3、8、12周时取材，以X线、显微镜、电镜及形态计量软件观察复合假体表面及内部骨生成情况。采用SPSS13.0进行t检验分析。结果三组植入物外表面HA涂层的组织生长情况类似；A组无孔，未见骨长入，B组和C组中骨组织最终可长入假体2 mm大的圆孔；各时间点C组中空腔内骨生长率均明显高于B组(P＜0.01)。结论骨质可经HPTP假体孔洞长入腔内，达到交锁固定，较无孔假体更稳定；中空腔复合CBM后可明显加快骨长入并诱导骨生成，使假体与骨质更好整合。

中空多孔；假体；骨生成；骨基质；组织学

人工关节置换已被证明是一种修复严重关节疾患的成熟技术，但远期仍存在假体寿命有限、骨溶解和无菌性松动等问题，患者面临翻修风险[1-2]。如何改进假体设计，仍是很有研究价值的课题。蔡谞率先提出了生物复合型中空多孔关节假体的设计构想，其理念是将假体与骨质接触部分设计为空心体，并利用复合于其中的骨诱导材料诱导周围骨质通过孔洞长入假体腔，达到更好的骨整合效果[3-4]。本研究拟分别将复合或不复合松质骨基质(Cancellous bone matrix，CBM)的中空多孔钛假体(Hollow porous titanium prostheses,HPTP)和无孔假体植入兔股骨髁内，定期取材，观察兔体内假体和CBM周围及内部骨生成可能性及组织学变化，以探讨人工假体与骨质整合的改进方法。

1 材料与方法

1.1 假体及松质骨基质的制备 32个HPTP假体和16个无孔假体均采用TC4钛合金棒材制作(图1A)。HPTP假体植入骨内部分为空心圆桶状，高8.5 mm，外径7 mm，内径6 mm，侧壁和底壁厚度均为0.5 mm，侧壁3排圆孔，每排6个，底壁圆孔有4个，共22个。实心假体制作规格同上，区别为侧壁与底壁无孔(图1A)。假体植入骨内的部分行HA等离子喷涂。6粒CBM由新鲜小牛松质骨制成。将长7.5 mm，直径5.5 mm的圆柱形骨柱进行去抗原处理，形成三维网孔状材料并分装(图1B)。所有假体和CBM均行环氧乙烷消毒备用。

1.2 方法

1.2.1 实验分组和动物手术 将实验植入材料分为无孔假体组(A组)、HPTP组(B组)和HPTP＋CBM组(C组，CBM被置入HPTP中空腔内)三组，每组16例。取48只4～6个月龄健康新西兰大白兔，体重2.5～3 kg，雌雄不限，将各植入体随机植入兔的右侧股骨外侧髁(图1C、图1D)。

1.2.2 标本的采取与制备 观察时间点为植入后3周、8周、12周，实验兔处死前第13天和第3天两次行四环素荧光标记，按50 mg/kg进行肌注，处死前行X线检查。标本截断面在髁上1 cm。每时间点每组各取五个标本用于不脱钙骨切片的观察，另取一个第12周的标本进行扫描电镜观察。

1.2.3 制作不脱钙骨切片 用不同浓度的酒精对标本逐级脱水，常温下将标本聚合包埋。骨标本用Leica 1600金刚砂不脱钙切片机进行连续切片，厚度为50 μm，行Giemsa染色并制作切片。采用Olympus BX51型生物显微镜和DP70图像采集系统进行观察。

1.2.4 制作电镜标本 将标本的界面组织分割成小块，制作电镜标本，用HITACHI S-4800型扫描电子显微镜观察。另对CBM的孔隙结构亦进行喷金镀膜及电镜观察。

1.2.5 骨形态计量学分析 B、C组每标本各取一片不脱钙骨组织切片，经计算机图像采集系统采集包括假体的整体图像，用Image-pro plus 6.0图像分析系统判断并计算中空腔内新生骨组织面积，算出新生骨形成率(新生骨形成率=新生骨组织面积/假体中空腔内部总面积×100%)。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，B、C组标本不同时间点的平均结果均以均数±标准差(±s)表示，组间新生骨形成率两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 整体观察和X线表现 取材时可见植入体与股骨髁骨质结合紧密，其周围骨质略增厚。术后3、8、12周X线提示：假体位置良好，无骨折。A组各时间点无明显变化，B、C组可见原假体孔洞部位骨质密度随时间延长增加，显影模糊。第12周时，B组螺帽下可见一层很薄的类骨样组织，其下中空腔内仍为纤维肉芽组织充填；C组内部已有骨状物存在，与假体内壁紧密相连，质地较坚硬(图2)。

2.2 光学显微镜观察 ①术后3周：各组假体表面有大量成骨细胞浸润，少量纤维组织和新生血管包绕，局部仍有血肿，并有少许新骨形成(图3A)。B组假体部分孔洞处可见有新生类骨质长入。C组原有CBM的结构仍清晰可见，无明显吸收，CBM周围及内部可见大量新生类骨质形成，有大量成骨细胞(图3B、图3C)。②术后8周：各组假体周围新生纤维组织明显减少，新生骨组织相对增加(图3D)。B组假体壁孔洞处可见更多新生骨形成，内部中空腔内纤维肉芽组织与术后3周相比无明显变化(图3E)。C组孔洞处新生骨明显，中空腔内原CBM结构部分被吸收，为新生骨小梁或类骨质所爬行替代(图3F)。③术后12周：各组假体表面有大量的新生骨形成，可见完整的骨小梁和哈佛氏管系统，骨-假体结合紧密。B组中空腔内机化的纤维组织较多，有少量稀疏的骨小梁组织，部分孔洞处见较多新生骨形成，与假体外骨组织相连，将假体中空腔封闭(图3G)。C组中空腔和孔洞处新生骨组织进一步增多，以成熟的骨小梁为主，纤维肉芽组织已明显减少，内部CBM大部分已被吸收(图3H、图3I)。

2.3 电镜观察 图4A可见CBM松质骨小梁内大量的三维网孔状结构。图4B为假体表面HA涂层外生成的骨质形态，越靠近HA新生骨小梁越致密，骨小梁间隙内可见散在的骨细胞，在各组假体周围均无明显区别。图4C为HPTP组长入假体孔洞内的骨组织，可见骨小梁网状结构，表面为膜状纤维和基质覆盖。图4D则提示HPTP假体内加载CBM后，其内生成的组织虽然混杂有部分纤维成分，但骨小梁结构和骨细胞存在，提示有骨样组织形成。

2.4 中空腔内骨形态计量学分析 对B、C组各时间点假体内的新生骨形成率进行t检验，P值均＜0.01，提示B、C组中空腔内部新生骨量比较差异有显著统计学意义，C组中空腔内骨生长率要明显高于B组，见表1。

图1 实验材料的植入

图2 C组和B组12周时标本外观

表1 各时间段B、C组植入体新生骨形成率(%，±s)

表1 各时间段B、C组植入体新生骨形成率(%，±s)

组别B组C组t值P值3周5.1±1.4 27.5±2.7 -16.5＜0.01 8周6.6±2.0 41.3±3.2 -20.6＜0.01 12周7.0±1.3 57.6±4.1 -26.3＜0.01

图3 术后不同时间点各组的光学显微观察结果

图4 电镜下CBM的微孔结构和假体周围新生骨结构

3 讨 论

如何提高假体表面骨长入，增加假体与周围骨床的结合力和范围，从而获得长期稳定，仍然是生物固定型假体不断改进的研究焦点。受骨收集室(Bone harvest chamber，BHC)[5]及椎间融合器等启发，有学者等提出中空多孔金属假体的设计构想，并进行了大量研究，取得了初步的肯定结果[3-4，6]。本实验在继续观察中空多孔假体骨-假体界面成骨效应的同时，进一步对中空多孔假体腔内成骨性能进行了对比研究，探讨CBM等骨诱导物质对HPTP假体腔内成骨的影响，试图为该设计应用于临床进一步奠定实验和理论基础。

生物固定型人工关节假体的稳定性除了依靠其几何形状达到初始稳定外，假体-骨界面的紧密结合对远期稳定至关重要[7]。对于后者，目前相关研究主要集中在假体材料选择及表面处理两个方面。在材料学短期内难以取得突破的情况下，新的假体表面处理方法不断涌现，如珍珠面、钛丝面、喷砂面、羟基磷灰石面等，特别是HA喷涂技术已被证明确实有利于假体与周围骨质更紧密地结合[8]。但总体上看，这些经过处理的假体与骨结合范围、深度和强度仍相当有限，骨结合率仅6%～35%[9]，只有少量的骨质长入假体表面，而且长入的骨质类似于盲端结构，相互交联少，骨代谢空间小，承受应力大且集中，对假体远期稳定性的帮助并不一定理想。本实验在既往研究的基础上进一步表明，设计为中空的假体除了假体-骨界面可以达到牢固结合外，骨质可经孔洞长入假体腔内，从而实现比表面嵌合更为牢固的假体-骨结合，为解决人工关节置换术后的松动问题提供了新的思路。

本研究结果发现，即使不添加成骨影响因子，界面骨质也可通过孔洞长入金属空腔体内并形成成熟的骨小梁。但要使通过孔洞长入假体腔内的骨再生最大化，合理的孔径大小与恰当的诱导应该是必要条件。目前，关于生物固定型假体多孔表面孔隙的最佳大小及密度尚无定论，有的学者认为孔隙在100～400 μm时较适合骨组织长入。本实验在综合参考以往实验效果的基础上，将孔洞大小定为2 mm，最终仍取得了较好的腔内成骨效果。良好的细胞支架已被证明可有效促进骨再生[10]。CBM具有良好的生物相容性和支撑强度。本实验将CBM置入HPTP中空腔内，试图诱导成骨细胞沿松质骨基质攀爬，从而有利于界面骨质经孔洞长入假体腔室内。结果证实，复合三维网状松质骨确实比单纯植入HPTP假体更有利于腔内成骨，从而更有利于假体与周围骨质的交锁结合。

中空多孔金属假体作为一种新的人工关节假体设计理念，尝试使假体与周围骨质形成前所未有的“一体化结合”，具有较高的可行性。在HPTP假体腔内复合骨诱导物质后，其腔内成骨效果更为明显。然而，如何将本研究结果应用于临床尚需进行进一步研究。

[1]Savvidou OD,Mavrogenis AF,Sakellariou V,et al.Salvage of failed total hip arthroplasty with proximal femoral replacement[J].Orthopedics,2014,37(10):691-698.

[2]BaghdadiYM,Jacobson JA,Duquin TR,et al.The outcome of total elbow arthroplasty in juvenile idiopathic arthritis(juvenile rheumatoid arthritis)patients[J].J Shoulder Elbow Surg,2014,23(9):1374-1380.

[3]蔡 谞.生物复合型中空人工关节假体[J].世界医疗器械,2004, 10(2):12-14.

[4]蔡 谞,崔 健,王 岩,等.张力侧中空股骨柄假体的研制及体外静力实验研究[J].中华骨科杂志,2006,26(5):332-335.

[5]Kälebo P,Jacobsson M.Recurrent bone regeneration in titanium implants.Experimental model for determining the healing capacity of bone using quantitative microradiography[J].Biomaterials,1988,9 (4):295-301.

[6]蔡 谞,王 岩,王继芳,等.rhBMP-2诱导界面骨长入中空金属植入物的初步实验研究[J].中华骨科杂志,2004,24(4):216-219.

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[8]Chen YL,Lin T,Liu A,et al.Does hydroxyapatite coating have no advantage over porous coating in primary total hip arthroplasty?A meta-analysis[J].J Orthop Surg Res,2015,10(1):21.

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Histological study of bone growth in hollow porous titanium prostheses loading cancellous bone matrix in vivo of rabbits.

WEI Jun-qiang1,CAI Xu2,TAO Sheng1,ZHANG Li2,ZHAO Bin2,WANG Ai-yuan2.1.Department of Orthopedics,Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital,Sanya 572013,Hainan,CHINA;2.Department of Orthopedics,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

Objective To observe the possibility of bone formation in vivo of rabbits with hollow porous titanium prostheses(HPTP)loading cancellous bone matrix(CBM),so as to improve the osteointegration between prostheses and bone.MethodsHPTP(2 mm in diameter)and non-porous prostheses coated with HA were designed.Experimental samples were divided into non-porous prosthesis group(group A),HPTP group(group B)and HPTP plus CBM group(group C),with 16 samples in each group.All the implants were implanted in the right lateral femoral condyles of 48 New Zealand rabbits of 4～6 months old,which were fed to 3,8,12 weeks later and sacrificed.SPSS13.0 software was used fort-test analysis.ResultsThe tissues around HA-coated implants in the three groups were nearly the same at different time points.No bone grew into Group A because of non-porous design,and bone could grow into the 2 mm round holes both in group B and C ultimately.Bone formation rates in group C were significantly higher than that in group B at different time points(P＜0.01).ConclusionBone could grow into the cavity of HPTP prostheses via the round holes to achieve locking fixation effect,which are more stable than non-porous prostheses. CBM could speed up bone ingrowth significantly and induce bone formation to achieve better integration of prostheses and bone.

Hollow porous;Prosthesis;Bone ingrowth;Bone matrix;Histological

R-332

A

1003—6350（2015）08—1097—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0394

2014-10-30)

国家自然科学基金（编号：30471755）

蔡 谞E-mail:476511077@qq.com