JNK信号通路抑制剂体内应用方法研究

陈新宇，杨 浩，蔡虎志，卢 青，陈青扬，陈毅君

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

JNK信号通路抑制剂体内应用方法研究

陈新宇1，杨 浩2，蔡虎志2，卢 青1，陈青扬2，陈毅君2

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

目的 探讨JNK信号通路抑制剂(SP600125)体内长期实验的应用方法。方法将40只新西兰兔随机分为八组：空白对照组、模型对照组、JNK高剂量组、JNK低剂量组、JNK空白组、DMSO模型组、DMSO空白组、阳性对照组。自实验第一天开始各组给予相应处理，连续4周。4周末检测实验兔心肌组织JNK总蛋白及蛋白磷酸化和基因表达水平。结果经阿霉素干预后，各组实验组心肌P-JNK表达均不同程度上调，其中以模型对照组、DMSO模型组上调最为明显(P＜0.05)。JNK低、高剂量组和阳性对照组心肌P-JNK表达水平上调较模型对照组缓慢(P＜0.05)，其中以JNK高剂组心肌P-JNK水平上调最为缓慢(P＜0.05)。各实验组间JNK总蛋白、JNK mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。结论连续4周小剂量皮下注射JNK信号通路抑制剂可以显著下调p-JNK的表达，该方法能够为体内长期实验研究提供思路。

JNK信号通路；抑制剂；DMSO；体内应用

JNK信号传导通路是MAPK信号通路家族成员之一，它是广泛存在哺乳动物细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞外界信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者，在众多的疾病进展过程中起着重要的作用。国内外学者已经较深透的探究了该信号通路，在对于该信号通路的研究过程中，抑制剂的应用是最常见的研究思路。

JNK信号通路抑制剂(SP600125)是丝/苏氨酸激酶广谱抑制剂，有效抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)，其体外实验和体内短期实验已较为成熟，但体内长期实验如何应用SP600125来干预JNK的通路蛋白则罕有报道。本实验旨在探索长期体内应用JNK信号通路抑制剂(SP600125)的方法，为相关研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 健康普通级雄性新西兰兔40只，质量(1.85±0.11)kg，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。动物许可证批号：SCXK(湘)2009-0012。在自由饮食、光/暗周期为12 h/12 h(光照时间为6:00～18:00)、背景噪音为(40±10)dB、温度(20±3)℃条件下饲养1周以适应环境。

1.1.2 主要药物与试剂 (1)阿霉素：深圳万乐药业有限公司生产(H44024359)；(2)乌拉坦：山东齐鲁兴华制药有限公司(H37022259)；(3)生理盐水：湖南科伦制药有限公司(H43020455)；(4)依那普利：江苏扬子江药业(H31021937)；(5)JNK抑制剂：美国SELLECK公司；(6)P-JNK抗体：美国Santa Cruz公司(sc-12882)；(7)JNK抗体：美国 Santa Cruz公司(sc-572)；(8)DMSO：美国SELLECK公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 采用完全随机分组设计，将40只实验兔按体重从小到大排列，用记号笔在右耳内侧进行编号，查随机数字表，将实验兔随机分为8组，分别为：空白对照组、模型对照组、JNK高剂量组、JNK低剂量组、JNK空白组、DMSO模型组、DMSO空白组、阳性对照组，每组实验兔5只。

1.2.2 JNK病理模型表达诱导 参照文献[1-2]，将注射用盐酸阿霉素用生理盐水稀释成1.0 mg/ml溶液，模型对照组、JNK高剂量组、JNK低剂量组、DMSO模型组、阳性对照组耳缘静脉注射，每次1.0 ml/kg，每周2次，连续4周。同时，空白对照组、JNK空白组、DMSO空白组中实验兔耳缘静脉注入0.9%生理盐水1 ml/kg。

1.2.3 给药方法 将JNK抑制剂SP600125用DMSO配成1 mg/ml母液，于耳缘静脉注射阿霉素的第一天开始，JNK低剂量组、JNK高剂量组、JNK空白组分别按照20 μg/(kg·d)、40 μg/(kg·d)、40 μg/(kg·d)配以生理盐水1 ml进行皮下注射。DMSO模型组、DMSO空白组按40 μl/(kg·d)配以生理盐水1 ml进行皮下注射；阳性对照组按人-兔体表面积换算后依那普利按5 mg/(kg·d)配以蒸馏水10 ml进行灌胃[3-4]。空白对照组以等量生理盐水处理。各组连续干预4周。

1.3 样本采集与检测

1.3.1 心肌组织总蛋白质提取 为观察及检测模型兔各项指标的的变化，将实验兔麻醉处死后迅速取左心室面心肌组织，置于干冰暂时冻存。把冻存的心肌组织转移至预先称质量的离心管中，称出样品的质量。然后按照约1:8(质量:体积)的比例加入组织裂解液混合，冰浴上机械匀浆，涡旋混匀，静置1 h，18 000×g、4℃离心30 min，取上清即为组中的总蛋白质，按Bradford方法测定蛋白质浓度，然后分装，-70℃保存备用。

1.3.2 Western-blot检测 将50 μg的心肌总蛋白加入2×SDS上样缓冲液(0.1 mol/L Tris pH 6.8，0.2 mol/L DTT，4%SDS，20%甘油，0.02%溴酚兰)，100℃变性8 min，上样，恒定电流，前15 min 16 mA/gel电泳，然后32 mA/gel电泳至底部。电转印按膜面积(0.8 mA/cm2)设定电流，转膜2 h。然后再用含3%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h。将膜取出，置于杂交袋中，分别加入抗JNK、P-JNK抗体，4℃过夜。TBS-Tween20漂洗10 min×3次，将膜取出，置于另一杂交袋中，加入酶标二抗，室温杂交2 h。TBST漂洗10 min×3次。ECL曝光显像、扫描、保存并分析。

1.3.3 RT-PCR分析 取左心室面心肌组织，参照TRI quick Reagent说明书，采用Trizol试剂一步法提取心肌组织的总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度并定量。然后根据Genebank中JNK基因序列进行引物设计，依照PCR反应试剂盒说明书进行JNK基因表达的RT-PCR分析。最后凝胶成像系统分析，计算光密度值。基因序列引物设计如下：JNKmRNA GenBank：AF014401.1；LEFT PRIMER 5'-CCGTCAGAATAAC-GAGACAAAAT-3'；RIGHT PRIMER 5'-AAGCCAGAGTCCTTCACAGACAA-3'；PRODUCTSIZE:101；GADPH GenBank:AF261085.1；LEFTPRIMER5'-ACCTTCAACACC-CCAGCCATGT ACG-3'；RIGHTPRIMER5'-CTGATCCACATCT-GC T GGAAGGTGGCA-3'；PRODUCTSIZE:134。

1.4 统计学方法 所有数据资料进行正态性检验，用SPSS17.0统计分析软件包进行处理，计量资料均采用均数±标准差(±s)表示，多组均数组间比较采用单因素方差分析，若方差齐时采用LSD法，若方差不齐时采用Tamhane'T2法，显著性水准P=0.05。

2 结果

2.1 动物数量变化 实验过程中，DMSO模型组、JNK高剂量组因反复腹泻，于实验结束前各死亡一只实验兔，考虑死亡原因为阿霉素推注速度过快引发急性中毒所致，正常对照组均生长良好。

2.2 实验后各组间心肌JNK的表达 实验后各组实验兔的心肌JNK表达见表1、图1。表1显示阿霉素干预后，各组心肌P-JNK均不同程度上调，与正常对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，其中以模型对照组上调最为明显(P＜0.05)。JNK低、高剂组和阳性对照组心肌P-JNK表达水平上调较模型对照组缓慢(P＜0.05)，其中以JNK高剂组心肌P-JNK水平上调最为缓慢(P＜0.05)。DMSO对照组及空白组心肌P-JNK水平分别与模型对照组、空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；各组实验兔各组间JNK总蛋白水平和JNK mRNA水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。这表明模型对照组JNK磷酸化蛋白上调，DMSO和JNK抑制剂对于正常心肌JNK磷酸化蛋白表达无影响，但经过依那普利和JNK抑制剂干预后的各组实验兔的JNK磷酸化蛋白均较模型对照组均有所下降，其中JNK40µg/kg较20µg/kg效果明显。

表1 实验后各组间心肌JNK的表达(±s)

表1 实验后各组间心肌JNK的表达(±s)

注：与正常对照组比较，aP＞0.05，bP＜0.05；与模型对照组比较，cP＜0.05，dP＞0.05；与JNK低剂组比较，eP＜0.05；与JNK空白组比较，fP＜0.05。

空白对照组模型对照组JNK低剂量组JNK高剂量组JNK空白组DMSO模型组DMSO空白组阳性对照组5 5 5 4 5 4 5 5 0.29±0.005 0.28±0.002a0.28±0.002a0.29±0.003a0.29±0.001a0.29±0.003a0.28±0.002a0.29±0.002a0.37±0.011 0.77±0.010b0.64±0.012bc0.56±0.012bcef0.28±0.011bce0.76±0.010bde0.38±0.012acef0.70±0.012bce0.27±0.020 0.28±0.019a0.28±0.018a0.27±0.020a0.28±0.018a0.26±0.020a0.27±0.019a0.27±0.018a

图1 JNK的表达

3 讨论

MAPK信号通路广泛存在哺乳动物细胞内的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，其可被一系列的细胞外信号及刺激而激活，经大量的研究证实其与多种疾病的发生发展密切相关。JNK信号通路是MAPK信号通路的成员之一，它是细胞外界信号由细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者[5]。经国内外学者证实JNK的基因主要有三个亚型，即JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2在组织中广泛表达，JNK3仅在脑、心和睾丸中表达[6]。大量的基础研究证实的JNK信号通路参与了细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架构建、细胞凋亡和细胞恶变等多种生物学反应，其主要通过JNK磷酸化蛋白的表达来调控相关反应[7-8]。国内外学者以该通路为突破口，对于许多疾病的病因开始探索，如Bogoyevitch等证实了在慢性心衰的动物模型中JNK的表达升高[9]；研究还证实高血压导致的心脏疾病中有p38和JNK的激活，同时在心肌细胞中表达JNK的上游激活因子，可以抑制心肌细胞肥大反应，延缓心力衰竭[10]；在衰竭的心肌细胞中活性氧簇(ROS)可以刺激位于JNK和p38上游区的细胞凋亡信号激酶-l，它的过度表达激活核因子κB (NF-κB)可导致心肌肥厚，以及促进凋亡信号激酶的激活进而导致心肌细胞凋亡[11-12]。

在细胞信号通路是实验研究中，抑制剂具有无可替代的地位。SP600125是ATP竞争性的c-Jun氨基末端激酶(JNK)选择性抑制剂，可显著抑制JNK介导的MAPK激活。同时SP600125也是一种高选择性JNK抑制剂，可作用于JNK1，JNK2和JNK3，经证实，比作用于MKK4选择性高10倍，比作用于MKK3、MKK6、PKB和PKCα选择性高25倍，比作用于ERK2、p38、Chk1、EGFR等选择性高100倍。目前现有文献报道的抑制剂的使用方法主要方法为体外的激酶实验、细胞实验以及在体动物实验。体外激酶实验和细胞实验证实SP600125可作用于多种细胞，如：Jurkat T细胞、从人脐血或外周血分离的Th0细胞等，抑制c-Jun磷酸化、抑制细胞活化和分化，且抑制炎症多种因子的表达，如：COX-2、IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达[13-15]。相关研究显示SP600125也抑制香烃受体(AhR)Mps1，和一系列其他丝/苏氨酸激酶，包括Aurora激酶A、FLT3、MELK和TRKA[16-18]。

SP600125的体内应用研究亦有部分报道，但使用方法多为大剂量静脉注入或口服后，在短时间内即处死实验动物，如：仇爱刚等[19]在SP600125对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用的研究中，在术前半小时腹腔注射SP600125 15 mg/kg。目前尚无抑制剂长期体内小剂量应用的文献报道，因此若要长期观察慢性疾病动物模型的病理发展过程和SP600125对其的干预作用，则需要更多有价值的实验和文献来体现。本研究采用阿霉素法诱导JNK信号通路发生异常改变，摸索出SP600125在体内长期实验过程中较为合适的使用方法，能够为相关基础研究提供一定的理论依据和研究思路。

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In vivo application method of JNK signal pathway inhibitor(SP600125).

CHEN Xin-yu1,YANG Hao2,CAI Hu-zhi2, LU Qing1,CHEN Qing-yang2,CHEN Yi-jun2.1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410007,Hunan,CHINA;2.Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410208, Hunan,CHINA

Objective To explore the method for the long-termin vivoapplication of JNK signaling pathway inhibitor(SP600125).MethodsForty New Zealand rabbits were randomly divided into 8 groups:blank control group, model control group,high-dose JNK group,low-dose JNK group,JNK blank group,DMSO model group,DMSO blank group,positive control group.All the experimental groups received the corresponding treatment for 4 weeks.After 4 weeks,the myocardial tissues of experimental rabbits were separated under anesthesia,and JNK total protein and p-JNK protein were measured bn Western blot.JNK mRNA expression was measured by RT-PCR.ResultsAfter intervention of ADR,myocardial P-JNK expression in each experimental group increased to different degrees,and the increases in the model control group,DMSO model group were the most significant(P＜0.05).Compared with model control group,the increases in myocardial P-JNK expression in low-dose JNK group,high-dose JNK group and positive control group were less significant(P＜0.05),and the myocardial P-JNK levels in high-dose JNK group increased most slowly(P＜0.05).The total protein of JNK,JNK mRNA expression of the experimental groups showed no significant difference(P＞0.05).ConclusionLow-dose subcutaneous injection of JNK signaling pathway inhibitor for four weeks can significantly lower the expression of p-JNK.

JNK signaling pathway;Inhibitor;DMSO;In vivoapplication

R-332

A

1003—6350（2015）08—1093—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0393

2014-11-16)

国家自然科学基金(编号：81173213/H2708)；湖南省科技厅科技计划项目(编号：2014SK3242)

陈新宇。E-mail：chenxinyuchen@163.com