来曲唑和脱氢表雄酮建立肾虚痰湿特征信息肥胖PCOS大鼠动物模型的对比研究❋

徐晓娟，黄映红，姚莉娟，邓琳雯，李宛静，王秋香，何蕴良

(1.成都中医药大学，成都610075;2.成都中医药大学附属医院，成都610072)

来曲唑和脱氢表雄酮建立肾虚痰湿特征信息肥胖PCOS大鼠动物模型的对比研究❋

徐晓娟1，黄映红1，姚莉娟1，邓琳雯2，李宛静1，王秋香1，何蕴良1

(1.成都中医药大学，成都610075;2.成都中医药大学附属医院，成都610072)

目的:对比来曲唑和脱氢表雄酮(Polycystic ovarian syndrome，DHEA)分别加高脂乳剂制作SD雌性大鼠肾虚痰湿特征信息肥胖PCOS动物模型的优缺点。方法:观察大鼠动情周期、体质量增加幅度，测定血清性激素、血脂、相关脏器指数水平和卵巢HE染色。结果:来曲唑联合高脂模型组大鼠体质量增加幅度、FSH、LH均极显著高于空白对照组和高脂模型组，LDL、TC、TG均显著高于余3组;DHEA联合高脂模型组大鼠E2、T均极显著高于空白对照组和高脂模型组，TC、TG、LDL均极显著高于其余3组;来曲唑模型组、来曲唑联合高脂模型组、DHEA模型组、DHEA联合高脂模型组大鼠卵巢HE染色均呈现多囊样改变。结论:来曲唑加高脂乳剂诱导是研究符合肾虚痰湿特征信息肥胖PCOS发病机制较理想的动物模型，DHEA加高脂乳剂诱导适用于血脂异常、雄激素和雌激素升高的不肥胖PCOS模型。

肥胖多囊卵巢综合征;来曲唑;脱氢表雄酮;高脂乳剂;动物模型

多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)是以排卵障碍、高雄激素血症和(或)胰岛素抵抗(IR)为特征的临床证候群，常始于青春期，其发病率高、发病原因多样、制作该模型方法众多，但至今尚无针对该病表现的相关特征万能模型［1］。李琴华等［2］认为，38%～88%的PCOS患者合并体质量超标或肥胖，肥胖型PCOS患者的代谢综合征发生风险明显增加。肥胖型PCOS以其高发性、异质性、难治性及终身性成为世界各国妇科临床和实验亟待研究的难题和热点。中医妇科临床对肥胖PCOS辨证为肾虚痰湿证型，其临床特征为月经延后或不潮、形体肥胖、多毛、舌苔白腻;现代医学检查有B超示不排卵和多个小卵泡，血清性激素指标中T、LH均升高，血脂指标多项升高，或伴有胰岛素抵抗、不孕症等特点。探索符合中医临床辨证肾虚痰湿型特征的肥胖PCOS动物造模方法，为中医临床治疗该病提供了实验研究的动物模型，对进一步深入探讨肥胖PCOS的发生发展和治疗具有深远意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

42 d龄清洁级SD雌性大鼠40只，体质量100～120 g，购于成都达硕生物科技有限公司(生产许可证号SCXK(川)2013-24，生产批号0018284)。采用随机数字表分为空白对照组、高脂模型组、来曲唑模型组和来曲唑联合高脂乳剂模型组每组各10只;选23 d龄清洁级SD雌性大鼠40只，体质量60～80 g，购于成都达硕生物科技有限公司(生产许可证号SCXK(川)2013-24，生产批号0018284)。采用随机数字表分为空白对照组、高脂模型组、DHEA模型组和DHEA联合高脂乳剂模型组每组各10只。分笼喂养，环境温度20～24℃，湿度40%～70%，每天光照10 h，自由饮水，喂以颗粒饲料。

1.2 试剂与仪器

来曲唑由江苏恒瑞医药股份有限公司提供(生产批号14030657 No.427)，DHEA购自美国IL公司，注射用油购自天津市北辰方正试剂厂(生产批号201407)、血清雌二醇(E2)(生产批号RG61407S)、睾酮(T)(生产批号RG41407)、促卵泡生成素(FSH)(生产批号GR61323)及促黄体生成素(LH)(生产批号RG63528)、放射免疫法检验试剂盒购自上海丽晶试剂股份有限公司。胆固醇购于河南兴源化工产品有限公司(20140524)，GC-1200放射免疫分析器购自科大创新股份有限公司中佳分公司，由成都中医药大学第一附属医院核医学科执行质控。

1.3 肥胖型PCOS动物模型的建立

1.3.1 来曲唑联合高脂乳剂造模法将来曲唑溶于10 g/L羧甲基纤维素(CMC)中，空白对照组大鼠灌胃10 g/L CMC，给予体积为15 ml/kg/d;高脂模型组大鼠灌胃高脂乳剂(猪油+胆固醇，猪油∶胆固醇=10∶3)，给予体积为15 mg/(kg·d);来曲唑模型组大鼠灌胃来曲唑1 mg/(kg·d)，来曲唑联合高脂模型组大鼠灌胃来曲唑1 mg/(kg·d)及灌胃高脂乳剂(猪油+胆固醇，猪油∶胆固醇=10∶3)，给予体积为15 ml/kg/d。大鼠均正常饮水，颗粒饲料喂养，于上午9时连续灌胃21 d。

1.3.2DHEA联合高脂乳剂造模法将DHEA溶于0.2 mL甘油中，空白对照组大鼠皮下注射生理盐水0.2 ml，同时灌胃羟甲基纤维素溶液(CMC，浓度为10 mg/ml)，给予体积为13 mg/(kg· d);高脂模型组大鼠灌胃高脂乳剂(猪油+胆固醇，猪油∶胆固醇=10∶3)，给予体积为15 mg/(kg·d); DHEA组大鼠皮下注射DHEA60 mg/(kg·d);DHEA联合高脂模型组大鼠皮下注射DHEA 60 mg/(kg· d)及灌胃高脂乳剂(猪油+胆固醇，猪油∶胆固醇= 10∶3)，给予体积为15 ml/kg/d。大鼠均正常饮水，颗粒饲料喂养，于上午10时连续灌胃21 d。

1.4 大鼠动情周期及体质量检测

各造模组均在造模处理第10天起每天进行阴道涂片，巴氏染色后观察动情周期的变化，1个动情周期为5 d，连续2个周期;每5 d测量大鼠的体质量并记录、绘制大鼠体质量增长变化曲线。

1.5 大鼠血清中性激素、血脂检测及脏器指数计算

各造模组均在造模处理第21天的晚上8时开始禁食，次日上午8时按3 g葡萄糖/kg体质量的剂量灌服50%葡萄糖液，灌糖后分别在0、120 min大鼠眼眶取血1 ml测定血糖。血糖测定采用GOPPOD终点法，在M10自动分析仪中测定。处死大鼠前，股动脉取血，室温下放置1 h，以2000 r/min速度离心10 min，分离血清。采用全自动生化分析仪检测高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)。取血清置-20℃冻存备用，采用放射免疫分析器测定E2、T、LH、FSH。取子宫、卵巢组织称重(剥离周围组织，迅速用电子天平称湿重并换算成脏器指数)，并选取双侧卵巢置10%中性甲醛中固定，最后处死。

1.6 统计学方法

采用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件PEMS3.1进行统计分析。

2 结果

2.1 一般情况

造模前，各组大鼠均发育良好，体毛润泽，行为、体征无明显差异，反应灵活。造模后，造模组与空白对照组比较皮毛显凌乱肮脏，尤其是高脂模型组。来曲唑模型组和来曲唑联合高脂模型组大鼠的体质量增加幅度均极显著高于空白对照组和高脂模型组，来曲唑模型组和来曲唑联合高脂模型组大鼠的子宫质量均显著低于空白对照组和高脂模型组。表1显示，高脂模型组、来曲唑模型组、来曲唑联合高脂模型组大鼠的垂体质量均显著高于空白对照组。表2显示，DHEA联合高脂模型组大鼠的体质量增加幅度显著低于DHEA模型组。高脂模型组大鼠的子宫质量极显著低于空白对照组，DHEA模型组大鼠子宫质量显著高于空白对照组，极显著高于高脂模型组，DHEA联合高脂模型组大鼠的子宫质量显著低于DHEA模型组，极显著高于高脂模型组。

2.2 动情周期变化

表3、4显示，来曲唑联合高脂乳剂造模法和DHEA联合高脂乳剂造模法中空白对照组大鼠均保持规律的4 d动情周期阴道涂片变化。来曲唑联合高脂乳剂造模法中高脂模型组大鼠动情前期、动情期及间期交替出现。来曲唑模型组大鼠持续4 d处于动情间期。来曲唑联合高脂模型组大鼠动情周期紊乱，持续处于动情间期，这点符合肥胖PCOS中医辨证肾虚的现代医学特征。DHEA联合高脂乳剂造模法中高脂模型组大鼠间期和动情期延长，DHEA模型组和DHEA联合高脂模型组大鼠失去正常动情周期，持续处于动情前期和动情期。这点也符合肥胖PCOS中医辨证肾虚痰湿证型的现代医学特?征。

表1 来曲唑联合高脂乳剂造模法大鼠体质量增加幅度和脏器指数水平

表2 DHEA联合高脂乳剂造模法大鼠体质量增加幅度和脏器指数水平

表3 来曲唑联合高脂乳剂造模法大鼠动情周期及排卵情况

表4 DHEA联合高脂乳剂造模法大鼠动情周期及排卵情况

表5 来曲唑联合高脂乳剂造模法大鼠血清性激素水平

表6 DHEA造模法大鼠血清性激素水平

2.4 血脂测定

来曲唑联合高脂模型组大鼠的TC、LDL均极显著高于空白对照组、高脂模型组和来曲唑模型组，来曲唑模型组大鼠的LDL极显著高于空白对照组和高脂模型组。表7显示，来曲唑联合高脂模型组大鼠的TG显著高于空白对照组、来曲唑模型组和高脂模型组。来曲唑联合高脂模型组大鼠的HDL显著低于空白对照组和高脂模型组，极显著高于来曲

2.3 血清性激素测定

来曲唑模型组大鼠的血清T浓度显著高于空白对照组和高脂模型组，来曲唑联合高脂模型组大鼠的血清T浓度显著高于来曲唑模型组和高脂模型组。表5显示，来曲唑模型组和来曲唑联合高脂模型组大鼠的LH和FSH浓度均显著高于空白对照组和高脂模型组。表6显示，DHEA模型组和DHEA联合高脂模型组大鼠的血清T、E2浓度均极显著高于空白对照组和高脂模型组，DHEA联合高脂模型组大鼠的血清T、E2浓度均极显著高于DHEA模型组。来曲唑模型组、来曲唑联合高脂模型组、DHEA模型组及DHEA联合高脂模型组的T、LH均升高，符合肥胖PCOS中医肾虚痰湿证型的现代医学血清性激素T、LH指标升高特征。唑模型组。DHEA联合高脂模型组大鼠的TC极显著高于空白对照组、高脂模型组和DHEA模型组。高脂模型组大鼠的TG显著高于空白对照组，DHEA模型组和DHEA联合高脂模型组大鼠的TG均极显著高于空白对照组，DHEA联合高脂模型组大鼠的TG极显著高于高脂模型组，显著高于DHEA模型组。DHEA联合高脂模型组大鼠的HDL极显著高于空白对照组，显著高于高脂模型组。表8显示，DHEA联合高脂模型组大鼠的LDL极显著高于空白对照组和高脂模型组，显著高于DHEA模型组。来曲唑联合高脂模型组和DHEA联合高脂模型组血脂明显升高，符合肥胖PCOS中医肾虚痰湿证型现代医学肥胖指标变化特征。

表7 来曲唑造模法血脂水平

表8 DHEA造模法血脂水平

2.5 大鼠卵巢HE染色

2造模法空白对照组大鼠卵巢表面较红，其余各造模组大鼠卵巢表面苍白。HE染色光镜下，空白对照组大鼠卵巢可见不同发育时期的初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、黄体和白体。2造模法高脂模型组大鼠可见少量的黄体和白体，闭锁卵泡和囊状卵泡较空白对照组增多。来曲唑模型组和DHEA模型组大鼠卵巢可见次级卵泡减少，囊状卵泡和闭锁卵泡增多，无排卵前的成熟卵泡、黄体和白体明显减少。来曲唑联合高脂模型组(图C2)和DHEA联合高脂模型组大鼠卵巢(图D 2)可见次级卵泡明显减少，无成熟卵泡，无黄体和白体。而来曲唑联合高脂模型组大鼠的卵巢多囊性改变较DHEA联合高脂模型组更加明显(如图A、B、C1、C2、D1、D2)。来曲唑联合高脂模型组大鼠(图C2)的典型卵巢多囊性改变，符合肥胖PCOS中医肾虚痰湿证型现代医学肥胖B超的卵巢影响学指标变化特征。

3 讨论

中医学认为，肾虚痰湿是多囊卵巢综合征的常见证型［3-4］。肾虚痰湿型肥胖PCOS主要特征如前述持续无排卵、T和LH增高及脂代谢紊乱等。肥胖型PCOS可导致患者的生殖内分泌及脂代谢发生紊乱，针对这些异常的特征指标对制作相应的模型大鼠为笔者课题组深入研究补肾化痰中药对肾虚痰湿肥胖大鼠调控机制［5］奠定了较理想的模型。

目前对PCOS的研究多借助于动物实验，常见方法有雄激素造模、芳香化酶抑制剂造模、孕激素联合HCG造模、胰岛素联合HCG造模和雌激素造模等10余种之多。姚莉娟等通过收集1979年以来公开发表的关于建立PCOS动物模型中文文献77篇，发现DHEA造模法E2、P、T、升高，FSH有升高有降低，LH降低。

来曲唑造模法可使体质量、卵巢质量、T、FSH、LH升高，黄体数、E2下降。文献［6-7］通过给予雌性大鼠持续应用来曲唑，导致大鼠出现排卵障碍、卵巢多囊样变。Akamine等［8］给予成年大鼠高脂饲料，持续120 d或180 d，2种模型组腹膜后及性腺周围脂肪、INS、HOMA指数均明显升高。杜丹峰等［9］认为，单独应用高脂饲料或高脂乳剂构建的PCOS模型在血清性激素及卵巢形态改变方面不典型，因此常与激素诱导法联合应用。以上3个模型指标较接近中医辨证肾虚痰湿特征信息，所以选择在来曲唑造模法和DHEA造模法的基础上进行改良，加用高脂乳剂造模，以期在2种近似肾虚痰湿特征信息肥胖PCOS中找到一种较佳的动物模型，从而为本课题组深入该病的实验研究奠定模型基础。

本研究结果表明，来曲唑模型组和来曲唑联合高脂模型组大鼠的体质量增加幅度均显著高于空白对照组和高脂模型组，DHEA联合高脂模型组大鼠的体质量增加幅度低于DHEA模型组。因此，来曲唑联合高脂乳剂造模法建立的动物模型符合PCOS肥胖的特点。2种造模方法中除外空白对照组维持正常动情周期外，其余各组均呈现不同的动情周期紊乱，如持续处于动情期、动情间期、无明显动情周期、动情周期延长大于6 d。来曲唑联合高脂模型组中血清LH、FSH、T均升高，DHEA联合高脂模型组中血清T、E2升高。2种造模法大鼠血清性激素均有改变，但来曲唑联合高脂乳剂造模法大鼠血清性激素水平改变更加全面，且DHEA联合高脂乳剂造模法大鼠血清T显著升高。但由于持续给予雄激素(DHEA)而难以区分内源性和外源性雄激素，使一些研究体内雄激素变化的实验受到干扰［10］。因此，来曲唑联合高脂乳剂造模法更适合用于研究PCOS血清性激素变化。来曲唑联合高脂模型组大鼠的TC、TG、LDL均升高、HDL降低，DHEA联合高脂模型组大鼠的TC、TG、HDL、LDL均升高。在PCOS造模的基础上加用高脂乳剂，能够更加明显地改变大鼠的血脂代谢，形成高脂血症，2种造模改良法均可用于研究TC、TG、LDL升高的PCOS。2造模大改良法大鼠卵巢HE染色均出现次级卵泡减少，无排卵前的成熟卵泡、囊状卵泡和闭锁卵泡增多，黄体和白体减少或不存在黄体和白体。

综上所述，这2种造模法均存在持续不排卵、高雄激素血症、高脂血症的特点，所以均可作为PCOS实验动物造模方法，且造模持续时间短、实验耗材少、能节约实验费用，可用于肥胖PCOS短期研究。来曲唑加高脂乳剂造模法大鼠体质量增加幅度、LH、FSH、T、TC、TG、LDL均升高，卵巢呈多囊样改变典型，大量的囊状卵泡和闭锁卵泡形成，与肥胖PCOS有较多相似之处，初步认为该法较适合用于研究具有中医肾虚痰湿特征信息肥胖PCOS动物模型。DHEA加高脂乳剂造模法T、E2、TC、TG、LDL、HDL均升高，卵巢呈多囊样改变，适合于雌激素、雄激素水平较高、血脂异常的不肥胖PCOS动物模型。

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Comparative Study of the Establishment of Kidney Deficiency and Phlegm Characteristic Information of Obese PCOS Rat Animal Model by Using the Triazole and DHEA

XU Xiao-juan1，HUANG Ying-hong1，YAO Li-juan1，DENG Lin-wen2，LI Wan-jing1，WANG Qiu-xiang1，HE Yun-liang1
(1．Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China; 2．Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China)

Objective:To establish two kinds of obese PCOS rats models which have the characteristics of the deficiency of kidney and phlegm-dampness with Letrozole and DHEA(Dehydroepiandrosterone)combined high fat emulsion respectively，and comparing with the advantages and disadvantages of the two models.Method:Observing the estrous cycle and the weight increasing rate of rats，and determine the serum sex hormone levels，blood lipid and related viscera index and ovaries HE staining.Results:The weight increasing rate of rats、FSH、LH in Letrozole combined high fat emulsion group was significantly higher than the blank control group and high fat emulsion group LDL、TC and TG were significantly higher than the other three groups;E2、T of DHEA combined high fat emulsion group were significantly higher than the blank control group and high fat emulsion group.TC、TG and LDL were significantly higher than the other three groups;The ovaries HE staining in Letrozole group、Letrozole combined high fat emulsion group、DEHA group and DHEA combined high fat emulsion group all showed polycystic syndrome.Conclusions:Letrozole combined high fat emulsion model is one of the ideal animal models to study obese PCOS with the pathogenesis of the deficiency of kidney and phlegm-dampness.DHEA combined high fat emulsion model fits for non-obese PCOS with the dyslipidemia，high testosterone and estrogen.

Obese PCOS;Letrozole;DHEA;High fat emulsion;Animal models

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0511-04

2015-02-15

成都中医药大学科技发展基金(ZRMS201307)-PCOS动物模型中肾虚痰湿型诊断要素的信息挖掘研究

徐晓娟(1969-)，女，江苏镇江人，副研究员，医学博士，硕士研究生导师，从事补肾中药对女性生殖内分泌调控研究，Tel:028-61800160，13980971928，E-mail:847956379 @qq.com。