硒胁迫对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响及对中华羊茅的化感作用

周连玉，云成玉，米 琴，乔 枫

（青海师范大学生命与地理科学学院，青海 西宁 810008）

硒胁迫对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响及对中华羊茅的化感作用

周连玉，云成玉，米 琴，乔 枫

（青海师范大学生命与地理科学学院，青海 西宁 810008）

通过液体和固体培养方式研究硒对黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens）生长的影响及其发酵液对中华羊茅（Festuca sinensis）种子萌发特性的化感作用。结果表明：与无硒培养基相比，浓度为1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1亚硒酸钠对菌落直径和菌丝体生物量具有显著抑制作用（P＜0．05）。黄绿蜜环菌富硒发酵液对中华羊茅幼苗生长指标的化感作用表现在稀释倍数越小，抑制作用越大；对幼苗不同生长指标的抑制作用由高至低依次为根长、苗长、苗鲜重、根鲜重；各生长指标之间存在显著的正相关性。

黄绿蜜环菌；硒；菌丝生长；化感作用

黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens） 是一种大型真菌，在青海主要生长在海拔3 000 m～4 300 m的草甸上，大多分布于海北（祁连、海晏、刚察）、黄南（泽库、河南）、海南（共和、贵德、兴海）、果洛（玛沁、甘德、久治） 及高海拔的玉树地区。此外，四川、西藏、河北、陕西、甘肃等省区也有分布[1]。其研究多集中于生理生态特性、生物学特征、人工培养、化学成分分析、分子鉴定等[2-11]。有研究报道黄绿蜜环菌蘑菇圈生长能明显增加植物群落的物种多样性及物种丰富度[2-5]。

硒（Se） 是维持人和动物正常生理功能的必需微量元素[12]，人和动物缺硒会引起多种疾病。无机硒在体内不易吸收且毒性强，只有通过生物作用使施加的外源无机硒转化为易被体内吸收利用的有机硒。诸多微生物如细菌、真菌具有富集硒的能力[13-17]，能转化硒的形态[18]，这些特性提高了菌类产品的营养价值和应用范围。

许多微生物的代谢产物如细菌、放线菌、真菌，具有不同程度的化感效应[19-21]。研究表明，低浓度的无机硒对种子萌发特性有促进作用，高浓度发挥抑制作用[22-26]；而研究微生物富硒发酵的代谢产物对种子萌发特性的影响少见报道。目前黄绿蜜环菌还属于野生，无法进行人工栽培。本试验以黄绿蜜环菌和中华羊茅（Festuca sinensis）为材料，结合液体和固体培养，研究不同浓度的亚硒酸钠对黄绿蜜环菌生长产生的作用，以及黄绿蜜环菌的富硒培养液对中华羊茅种子萌发特性的影响，以期为富硒黄绿蜜环菌和化感物质的生产提供一定的理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1．1．1 菌种

黄绿蜜环菌菌株由青海师范大学微生物实验室提供。

1．1．2 培养基

PDA培养基：马铃薯（去皮） 20%、葡萄糖2%、琼脂2%，pH自然。

深层发酵培养基：蔗糖4%、牛肉膏0．1%、KH2PO40．1%、MgCO30．1%。

1．1．3 植物种子

中华羊茅种子由兰州大学草地保护所提供。

1.2 试验方法

1．2．1 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌落直径的影响

分别以硒浓度 0（CK）、1．0 mmol·L-1、2．0 mmol·L-1、4．0 mmol·L-1、8．0 mmol·L-1添加到90 mm PDA平板中，用打孔器将黄绿蜜环菌菌落打孔成直径4 mm的菌块，接种于平板中央，每个处理重复3个培养皿，25℃培养7 d后，测量菌落直径。

1．2．2 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌丝体生物量影响

分别以硒浓度 0（CK）、1．0 mmol·L-1、2．0 mmol·L-1、4．0 mmol·L-1、8．0 mmol·L-1添加到发酵培养基中，将3块4 mm的菌块接到发酵培养基，250 mL三角瓶中装入培养液100 mL，25℃、130 r·min-1培养8 d，培养液过滤获得菌丝体和发酵液。菌丝体于60℃干燥至恒重，电子天平称重测得菌丝体生物量。发酵液用于活性测定。

1．2．3 黄绿蜜环菌富硒发酵液对中华羊茅幼苗生长的影响

挑选籽粒饱满的中华羊茅种子，首先用75%的酒精表面消毒1 min，然后用无菌水冲洗3次，将种子分别在不同硒浓度的发酵液原液（X）、2倍（2X）稀释液、3倍（3X） 稀释液、4倍（4X） 稀释液中浸泡24 h，以无菌水作对照，将种子放到铺有二层灭菌滤纸的培养皿中，每皿50粒，每日补充无菌水，以润湿滤纸为准，设3个重复，14 d后测定根长、苗长，并称量其鲜重。用抑制率来衡量富硒发酵液对中华羊茅的化感作用情况，抑制率（P） 公式为：

式中：L1表示对照值；L2表示处理值。

1.3 统计分析

试验数据结果均采用平均值±标准误表示，各项测定指标采用SPSS16．0统计分析软件进行单因素方差分析（LSD，P＜0．05）。采用Spearman’s rho方法进行生长指标之间的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌落直径的影响硒对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响见图1。

图1 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌落直径的影响Fig．1 Effect of the concentration of Se on the mycelial diameter of Armillaria luteo-virens

由图1可见，随着硒浓度的升高，黄绿蜜环菌菌落生长速度逐渐减慢，对照浓度的菌落直径显著大于硒浓度的菌落直径（P＜0．05）。在硒处理组中，浓度为2．0 mmol·L-1和4．0 mmol·L-1时，菌落直径显著小于浓度为1．0 mmol·L-1的菌落，但显著大于浓度为8．0 mmol·L-1的菌落（P＜0．05）。

2.2 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响

不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响见图2。

图2 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响Fig．2 Effect of the concentration of Se on the mycelial biomass of Armillaria luteo-virens.

由图2可知，黄绿蜜环菌对硒具有很强的耐受力，在液体培养基硒浓度高达8．0 mmol·L-1时，菌丝生物量仍达到0．68 mg·mL-1。不添加硒的菌丝体生物量显著高于添加硒的菌丝体生物量（P＜0．05），且随着硒浓度的增加生物量逐渐下降。当硒浓度为4．0 mmol·L-1和8．0 mmol·L-1时，菌丝体生物量显著低于硒浓度为1．0 mmol·L-1（P＜0．05）。

2.3 黄绿蜜环菌富硒发酵液对中华羊茅幼苗生长的影响

黄绿蜜环菌富硒发酵液对中华羊茅幼苗生长的影响见表1。

由表1可见，各处理组与对照相比，不同浓度的富硒发酵液对中华羊茅种子萌发后苗长、根长、苗鲜重和根鲜重均表现为显著的抑制作用（P＜0．05)。相同浓度的富硒发酵液稀释倍数越小，其抑制作用越大，对中华羊茅的不同生长指标抑制作用由高到低普遍表现为根长＞苗长＞苗鲜重＞根鲜重。

富硒发酵液对中华羊茅幼苗生长指标的相关分析见表2。

由表2相关性分析可知，富硒发酵液作用下苗长与根长、苗鲜重或根鲜重之间相关系数较高，分别为 0．696、0．954、0．945，均达到极显著水平（P＜0．01）；根长与苗鲜重、根鲜重之间呈极显著正相关，相关系数分别为0．938和0．884；苗鲜重与根鲜重之间相关系数高达0．961。可见，在富硒发酵液的作用下，中华羊茅的各项生长指标相关性较高。

表1 黄绿蜜环菌富硒发酵液对中华羊茅幼苗生长的影响Tab．1 Effect of the Se-enriched fermentation of Armillaria luteo-virens on Festuca sinensis seedling growth

表2 富硒发酵液对中华羊茅幼苗生长指标的相关分析Tab．2 Correlation of seedling growth criteria of Festuca sinensis affected by the Se-enriched fermentation of Armillaria luteo-virens

3 讨论

近年来灵芝 （Ganoderma lucidum）、蜜环菌（Armillaria mella） 等食用菌作为富硒载体开发为富硒产品，已引起学者们的关注。许多研究发现适当浓度的硒能促进真菌生长，但高浓度的硒抑制真菌生长[27-29]。何冬兰等[27]研究Na2Se2O3对灵芝菌丝生长的影响，0．05 mmol·L-1～1．0 mmol·L-1的Na2Se2O3可促进菌丝生长，硒浓度高于1．0 mmol·L-1时菌丝体生长量呈现下降趋势。王蓉等[28]研究硒对2种灵芝菌生长的影响，认为硒抑制固体培养基上灵芝菌的生长，2种灵芝菌的耐受能力不同，其固态培养的耐硒能力显著高于液态培养。唐巧玉等[29]发现硒浓度小于10 mg·L-1时能够促进蜜环菌生长，超过此浓度起到抑制作用。本研究发现黄绿蜜环菌在固体培养和液体培养时，硒浓度为1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1时均对其产生不良影响，可能是因黄绿蜜环菌比较敏感，而培养基中添加硒的浓度过高所引起。

有相关研究报道，低浓度外源硒对植物幼苗生长有促进作用，而高浓度的硒表现出显著的抑制作用[22-26]。真菌发酵液中存在化感物质，对植物生长表现出促进或抑制作用[20-21]。吴丽伟等[21]报道不同浓度的蜜环菌发酵液促进油菜幼苗的伸长，增加单株的干重，但对根系的伸长表现抑制作用。目前真菌在无机硒作用下的发酵液影响植物幼苗生长的研究报道较少，本试验研究黄绿蜜环菌富硒发酵液对中华羊茅幼苗生长指标的化感作用，发现富硒发酵液稀释倍数越小抑制作用越大，对幼苗不同生长指标的抑制作用由高至低依次为根长、苗长、苗鲜重、根鲜重（表1），且各生长指标之间存在显著的正相关性（表2）；通过各浓度之间的比较发现，富硒发酵液对各生长指标的抑制作用，随着浓度的升高而表现出加强的趋势，除浓度为1．0 mmol·L-1和2．0 mmol·L-1富硒发酵液的4倍稀释液外，其它硒浓度下的发酵液对根长和苗长的抑制率均在90%以上，化感效果好。本研究中，有些相邻浓度处理之间存在作用趋势不明显的结果，这可能是由于富硒发酵液中包含多种具有化感作用的物质，其对幼苗各项生长指标的作用是受多种代谢物共同作用所致，这些结果与前人的研究具有一定的一致性[20-21]。对于发酵液中硒的化学形态及含量是否与化感作用有关，需要做进一步的研究。

[1]刁治民．青海草地黄绿蜜环菌生态学特性及营养价值研究[J]．中国食用菌，1997，16（4）：21-22．

[2]王文颖，王启基，姜文波．黄蘑菇的生长对草地植被及土壤的影响[J]．草业学报，2004，13（4）：34-38．

[3]王启兰，姜文波，陈波．黄绿蜜环菌蘑菇圈生长对土壤及植物群落的影响[J]．生态学杂志，2005，24（3）：269-272．

[4]陈立红，阎伟，刘建．草原蘑菇圈对牧草长势影响的初步分析[J]．西北植物学报，2002，22（6）：1421-1425．

[5]雷茜，王文颖．野生黄蘑菇圈对草地植被及土壤的影响[J]．西北民族学报：自然科学学报，2000，21（2）：42-46．

[6]边世平．青海祁连黄蘑菇营养成分分析[J]．营养学报，2005，27（5）：439-440．

[7]周连玉，邓旭武，朱莉莉．中草药浸提液对黄绿蜜环菌生长的研究[J]．北方园艺，2010（6）：207-208．

[8]周连玉，朱莉莉，邓旭武，等．黄蘑菇深层发酵条件的研究[J]．湖南农业大学学报：自然科学版，2010，36（1）：110-112．

[9]党军，王瑛，陶燕铎，邵赟，等．黄绿蜜环菌菌丝体水提物多糖含量测定[J]．光谱实验室，2011，28（6）：2836-2840．

[10]白世俊，包锦渊．黄绿蜜环菌有效成分的定性分析[J]．北方园艺，2012（3）：161-163．

[11]李海波，吴学谦，王立武，等．青藏高原黄绿蜜环菌纯培养菌种的分离培养及分子鉴定[J]．菌物学报，2008，27（6）：873-883．

[12]Palmer KM,Stanton NL,Ben-David M,et al．Are pikas exposed to and affected by selenium deficiency[J]．Journal of Wildlife Disease,2007,43(3):475-484．

[13]Rael RM,Frankenberger WT．Influence of pH,salinity,and selenium on the growth of Aeromonas veronii in evaporationagricultural drainage water[J].Water Research,1996,30(2): 422-425.

[14]Arnaudguihem C,Bierla K,Ouerdane L,et al.Selenium metabolomics in yeast using complementary reversed-phase/ hydrophilic ion interaction (HILIC) liquid chromatography-electrospray hybrid quadrupole trap/Orbitrap mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2012,757(C):26-38.

[15]刘丽梅，赵红卫，傅春蓉，等.沼泽红假单胞菌富硒发酵条件的研究[J].微生物学杂志，2010，30（5）：96-101.

[16]夏志兰，喻桃生，周连玉，等.灵芝液体发酵条件的优化研究[J].微生物学杂志，2007，27（2）：10-15.

[17]凌宏通，宋斌，林群英，等.富硒食用菌的研究进展[J].微生物学杂志，2008，28（4）：78-84.

[18]Schiling K,Johnson TM,Wilche W.Isotope fractionation of selenium during fungal biomethylation by Alternaria alternata[J].Environmental Science and Technology,2011,45(7): 2670-2676.

[19]徐开杰，燕明献，柴乖强，等.农杆菌不同菌液浓度对柳枝稷种子萌发及幼苗生长发育的影响[J].草业学报，2012，21（1）：206-212.

[20]孙锋.木霉发酵产物对抗虫棉种子萌发及苗期生长的影响[J].作物杂志，2009（2）：33-35.

[21]吴丽伟，王秋颖，苏明声，等.蜜环菌发酵液化感效应的初步研究[J].菌物学报，2010，29（1）：119-124.

[22]缪树寅，梁东丽，赵文龙，等.硒酸盐和亚硒酸盐对7种不同基因型小麦种子萌发和幼苗生长的影响[J].农业环境科学学报，2013，32（10）：1934-1940.

[23]何士敏，张燕，易涵.硒浸种对豌豆种子萌发的生理生化效应[J].种子，2012，31（2）：42-47.

[24]杨亚，朱列书，彭细桥，等.硒对烟草种子萌发的影响[J].湖南农业大学学报：自然科学版，2012，38（3）：241-244.

[25]李红侠，刘小阳，陈红玲，等.硒对胡萝卜种子萌发和幼苗生长的影响[J].宿州学院学报，2012，27（1）：47-48.

[26]郭锋，樊文华.外源硒对镉胁迫下芥菜种子萌发生理效应的影响[J].华北农学报，2013，28（4）：130-133.

[27]何冬兰，黄六容，刘梅芳.硒对灵芝菌丝生长及胞外酶活性的影响[J].中国食用菌，2005，24（2）：42-43.

[28]王蓉，师俊玲，樊明涛.硒对两种灵芝菌生长的影响[J].食用菌，2007（3）：5-8.

[29]唐巧玉，周毅峰，秦恩华，等.硒对蜜环菌的作用规律及其在多糖中的积累[J].食品与发酵工业，2007，33（10）：96-98.

Effects of Selenium on the Mycelial Growth of Armillaria luteo-virens and Allelopathy of Fermentation Broth on Festuca sinensis

ZHOU Lian-yu,YUN Cheng-yu,MI Qin,QIAO Feng
(College of Biology and Geography,Qinghai Normal University,Xining 810008,China)

The effects of selenium on the mycelial growth of Armillaria luteo-virens when the strain grew in solid and liquid media,and allelopathy of fermentation broth of the strain on Festuca sinensis seed germination were studied．The results showed that Na2Se2O3(1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1)could inhibit significantly mycelial diameter and biomass (P＜0．05)compared with the control cultures．Effects of the Se-enriched fermentation of A.luteo-virens on F.sinensis seedling growth demonstrated that growth inhibitions increased as the concentration of the Se-enriched fermentation increased,and inhibitory of different growth criteria was root length＞seedling length＞seedling fresh weigh＞root fresh weigh．There were significant positive correlation among different growth criteria (P＜0．01)．

Armillaria luteo-virens;selenium;mycelial growth;allelopathy

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0045-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．012

周连玉（1976），女，博士，副教授，主要从事微生物方面研究。E-mail:zly7604@163．com

2015-09-10