分枝虫草液体培养基筛选及其菌丝成分分析*

林 敏，宋 斌，黄 浩，李 挺，沈亚恒

（广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州，510070）

〈栽培技术〉

分枝虫草液体培养基筛选及其菌丝成分分析*

林 敏，宋 斌**，黄 浩，李 挺，沈亚恒

（广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州，510070）

以分枝虫草（Cordyceps ramosa）菌丝生物量作为指标，研究不同碳源和氮源对分枝虫草液体培养的影响，采用正交设计试验法筛选最佳液体培养基配方，并分析菌丝主要营养成分。结果表明，分枝虫草液体培养基的最佳碳源为甘油，最佳氮源为硝酸钾，最佳配方是：甘油35 g·L-1、硝酸钾12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麦芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L；其菌丝的粗蛋白、粗脂肪和总灰分含量分别为32．90%、1．20%和5．89%，其腺苷、多糖和虫草酸的含量分别为0．805%、5．89%和5．61%；含有17种氨基酸，总含量为23．97%；微量元素铁、锰、铜、锌和硒含量分别为76．70 mg·kg-1、5．10 mg·kg-1、3．70 mg·kg-1、33 mg·kg-1和0．176 mg·kg-1，重金属铅、砷、汞的含量均符合国家食用菌相关标准。分枝虫草的液体培养可作为分枝虫草开发利用的重要途径。

分枝虫草；液体培养基；正交试验；成分分析

中国虫草种类至今已报道的名称已经超过130种[1-2]。已开发利用的有冬虫夏草（Cordyceps sinensis）、蝉花虫草 （C.sobolifera）、古尼虫草 （C. gunnii）、蛹虫草 （C.militaris）、广东虫草 （C. guangdongensis） 等[3-7]。分枝虫草 [C.ramosa Teng= Elaphocordyceps ramosa (Teng)G.H.Sung,J.M.Sung &Spatafora]也称分枝团囊虫草、分枝鹿虫草、大团囊枒，在分类上隶属于子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes） 肉座菌目（Hypocreales） 线虫草科 （Ophiocordycipitaceae） 鹿虫草属 （Elaphocordyceps）。分枝虫草在安徽、福建、甘肃和广东等省区有分布，民间常用于治疗妇科出血症，包括崩漏、月经过多、更年期子宫出血、产后恶露不绝和宫内节育器所致子宫出血等，是具有药用价值的中国特有真菌[8-9]。分枝虫草野生资源贫乏，难于满足市场需求。林敏等[10-11]对分枝虫草的生物学特性、子实体生长最适碳氮源和子实体主要成分的研究分析表明，分枝虫草具有商业应用价值。本文对分枝虫草液体培养基的最适碳源、最适氮源和最佳配方进行了筛选，并对其菌丝的主要成分进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

菌株GDIM_CR 4003605，由广东省微生物研究所微生物资源中心提供，于4℃下保藏备用。

1.1.2 试验材料

可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖均为分析纯，硝酸钾、蛋白胨、麦芽浸出物、酵母浸膏、琼脂为生化试剂，黄豆粉、马铃薯从市场上直接购买。

1.2 基础培养基

1.2.1 PDA斜面培养基与配制

PDA斜面培养基组成：马铃薯200 g、琼脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL。取马铃薯洗净去皮，称取200 g切成小块，加水煮沸30 min，用4层纱布过滤，滤液加入琼脂粉20 g，煮沸溶解后加葡萄糖20 g，补水至1 000 mL，pH值自然，分装10 mL到20 mm×200 mm的试管内，于115℃灭菌20 min，排成斜面，冷却至常温后备用。

1.2.2 基础液体培养基及配制

基础液体培养基组成：碳源I（10 g·L-1）、氮源I（5 g·L-1）、酵母浸膏（3 g）、麦芽浸出物（3 g），水1 000 mL。取碳源I 10 g·L-1、氮源I 5 g·L-1、酵母浸膏3 g·L-1、麦芽浸出物3 g·L-1，补水至1 000 mL煮沸，用0.1 mol·L-1的HCl及0.2 mol·L-1的NaOH调pH至7.0，每个300 mL三角瓶分装100 mL液体培养基，于115℃灭菌20 min，冷却至常温备用。

1.3 试验方法

1.3.1 液体培养与菌丝收集

将供试菌株取出，按常规方法接种于PDA斜面培养基上，置于（25±1）℃下培养活化，待菌丝长满斜面后于4℃下保藏备用。取活化的斜面菌种，在无菌条件下每瓶接入约0.5 cm2大小的活化菌种8块，置于（25±1）℃，120 r·min-1振荡培养10 d即收集培养液。采用干质量法，把收集的培养液，以转速4 500 r·min-1，离心20 min，倾弃上清液，得到的沉淀即菌丝，置于（60±1）℃烘干至恒重，用分析天平称量。取3次重复试验的均值即得菌丝生物量（干重，g·L-1）。

1.3.2 不同碳源对分枝虫草液体培养菌丝的影响

以蛋白胨5 g·L-1替代基础液体培养基中的氮源I，以10 g·L-1的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖分别替代基础液体培养基中的碳源I，依1.2.2配制成5种不同的液体培养基，以基础液体培养基中的碳源I空白作对照。每种培养基配方设3个重复。以菌丝生物量为指标，研究不同碳源对分枝虫草液体培养菌丝生长的影响。

1.3.3 不同氮源对分枝虫草液体培养菌丝的影响

以葡萄糖10 g·L-1替代基础液体培养基中的碳源I，以5 g·L-1的硝酸钾、蛋白胨、奶粉、黄豆粉分别替代基础液体培养基中的氮源I，依1.2.2配制成4种不同的液体培养基，以基础液体培养基中的氮源I空白作对照。每种培养基配方设3个重复。以菌丝生物量为指标，研究不同氮源对分枝虫草液体培养菌丝生长的影响。

1.3.4 液体培养基筛选的正交试验

以研究得到的最适碳、氮源、酵母浸膏、麦芽浸出物为因素，采用L9（34） 正交设计液体培养基（表1）。每组试验设3个重复。以菌丝生物量为指标，筛选最佳分枝虫草液体培养基配方。

1.3.5 液体培养菌丝的成分测定

采用最佳液体培养基配方获得的菌丝，烘干至恒重，粉碎后过20目筛。粗蛋白含量参照GB/ T5009.5-2010/6.1第一法测定[12]；粗脂肪含量参照GB/T 5009.6-2003重量法 (第二法)测定[13]；总灰分含量参照GB 5009.4-2010重量法测定[14]；粗多糖、

表1 正交试验因素水平表Tab．1 Levels and factors of the orthogonal experiment in this study

虫草酸、腺苷和虫草素均参照测马莺等测定[15]；氨基酸的含量参照GB/T18246-2000碱水解法进行测定[16]。Fe、Mn参照GB/T5009．90－2003FAAS法进行测定[17]；Cu参照GB/T5009．13－2003FAAS第一法进行测定[18]；Zn参照GB/T5009．14－2003FAAS第一法进行测定[19]；Se参照GB/T5009．93－2010第一法进行测定[20]；Pb参照GB/T 5009．12-2010第一法GFAAS进行测定[21]；Hg参照GB/T 5009．17-2003第二法CVAAS进行测定[22]；As参照GB/T 5009．11-2003第一法HGAFS进行测定[23]。

1．3．6 数据分析

试验数据采用 Excel 2003、SPSS17．0(SPSS Inc．，Chicago，IL)软件进行统计分析[24]。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对分枝虫草液体培养菌丝生长的影响

不同碳源对分枝虫草液体培养菌丝生长的影响见图1。

图1 不同碳源对分枝虫草液体培养菌丝生长的影响Fig．1 Effect of carbon sources on mycelial growth of Cordyceps ramosa

由图1可见，分枝虫草菌丝体在包括对照在内的6种不同供试碳源液体培养基中均能生长，但不同碳源对菌丝生长的影响各有不同。以甘油作碳源时，菌丝生长速度快，菌丝团个大，生物量均值为1．278 g·d-1；其次以葡萄糖作为碳源时，菌丝生长较快，生物量均值为1．159 g·d-1；而以麦芽糖作为碳源时，菌丝生长较差，生物量均值为0．479 g·d-1；最差为对照组，生物量均值仅为0．443 g·d-1。分枝虫草在不同碳源液体培养基中菌丝生物量由多到少的顺序依次是：甘油＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞蔗糖＞麦芽糖＞对照。经方差分析，显示不同碳源对分枝虫草液体培养菌丝生物量的影响无显著差异。

2.2 不同氮源对分枝虫草液体培养菌丝生长的影响

不同氮源对分枝虫草液体培养菌丝生长的影响见图2。

图2 不同氮源对分枝虫草液体培养菌丝生长的影响Fig．2 Effect of nitrogen sources on mycelial growth of Cordyceps ramosa

由图2可见，分枝虫草菌丝在5种不同供试氮源液体培养基中均能生长，但不同氮源对菌丝生长的影响各有不同。以硝酸钾为氮源时，菌丝生长最好，生长速度最快，菌丝团个大，生物量均值为1．216 g·d-1；其次以黄豆粉作为氮源时，菌丝生长较好，菌丝团个也大，生物量均值为1．201 g·d-1；奶粉作为氮源时菌丝团个较小，生物量均值为0．676 g· d-1；而对照组则最差，菌丝团个最小，生物量均值仅为0．618 g·d-1。分枝虫草在不同氮源液体培养基中菌丝生物量由多到少的顺序依次是：硝酸钾＞黄豆粉＞蛋白胨＞奶粉＞对照。经方差分析表明，不同氮源对分枝虫草液体培养菌丝生物量的影响有显著差异。

2.3 液体培养基筛选结果

以甘油、硝酸钾、酵母浸膏、麦芽浸出物为四因素三水平的正交试验结果见表2。

表2结果表明，甘油35%（3水平），麦芽浸出物10%（2水平），硝酸钾12%（2水平），酵母浸膏12%（3水平）时，菌丝生物量最高，最佳水平组合为A3B2C2D3。极差R值分析显示，甘油（A）对分枝虫草菌丝生物量的影响最大，其次为酵母浸膏（D），再是麦芽浸出物（B），最差是硝酸钾（C）。因此，分枝虫草液体培养基的最佳配方为：甘油35 g·L-1、硝酸钾12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麦芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L。

表2 分枝虫草液体培养基L9（34）正交试验结果（n=3)Tab．2 Result on the orthogonal test of L9（34） in the liquidculture medium of Cordyceps ramosa(n=3)

2.4 分枝虫草液体培养菌丝的成分分析

2．4．1 常见营养活性成分

经检测，分枝虫草液体培养菌丝的粗蛋白、粗脂肪和总灰分含量分别为32．90%、1．20%和5．89%。腺苷含量为0．805%、粗多糖含量为5．89%、虫草酸含量为5．61%，虫草素的含量低于0．001%。

2．4．2 氨基酸组成与含量

分枝虫草菌丝氨基酸组成与含量情况见表3。

从表3可以看出，分枝虫草液体培养菌丝含有17种氨基酸，总含量为23．97%。其中必需氨基酸总含量达到7．82%。谷氨酸含量最高（2．86%），其次是脯氨酸（2．39%）。

2．4．3 微量元素含量

经检测，分枝虫草液体培养菌丝的微量元素含量情况见表4。

由表4可以看出，铁、锰、铜和锌的含量分别为76．70 mg·kg-1、5．10 mg·kg-1、3．70 mg·kg-1和33mg·kg-1；硒含量（0．176 mg·kg-1） 与子实体（0．046 mg·kg-1）相比[11]，要高出3倍，砷的含量低于0．50 mg·kg-1，而铅、汞含量低于0．10 mg·kg-1。

表3 分枝虫草菌丝主要氨基酸组成与含量Tab．3 Composition and content of main amino acids in Cordyceps ramosa mycelium

表4 分枝虫草菌丝微量元素含量Tab．4 Microelement content in Cordyceps ramosa mycelium

3 小结

在本试验条件下，分枝虫草液体培养基的最佳碳源是甘油，最佳氮源是硝酸钾。这与固体培养基的菌丝生长情况不同[10]，但与子实体的需要情况类似[11]。研究获得的最佳配方为：甘油35 g·L-1、硝酸钾12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麦芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L。

本研究结果表明，与分枝虫草子实体的粗蛋白（17．9%）、粗脂肪（1．02%）、灰分（2．50%）、多糖（0．01%）、虫草酸 （4．83%） 和氨基酸总含量（12．392%）等成分相比，分枝虫草菌丝的主要营养成分含量均较高[11]；但其虫草酸含量远低于广东虫草（46．3%）[25]，与蛹虫草（5%～7%）相近[26]；与冬虫夏草相比，成分基本相似，但分枝虫草腺苷的含量是冬虫夏草 （0．3755%） 的 2．1倍[27]，是广东虫草（0．25%）的3．22倍[25]。重金属铅、砷、汞等的含量均符合国家食用菌标准的安全要求[28-30]。

因此，分枝虫草的液体培养可作为分枝虫草开发利用的重要途径，具有潜在的应用前景，值得深入研究。

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书讯

《食用菌营养与烹饪》由湖南省食用菌研究所与中国食用菌协会、中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所共同编写，主要包括毒菌类的识别方法、食用菌的选购与贮藏、食用菌的营养与保健作用、食用菌经典菜式等内容，重点介绍39种常见食用菌141个菜品的烹饪方法。烹饪方法结合了多地菜肴的特色，兼顾营养、口味、地域及烧、蒸、煮等各种制作技巧的使用，菜式丰富、搭配合理。内容详实、图片精美，实用性强。

本编辑部现有少量存书，欲购者可直接汇款至中国食用菌杂志编辑部，本书售价30元，平邮加邮寄费5元，挂号加邮寄费10元，联系电话0871-65151099。

《中国食用菌》编辑部

Optimization of the Liquid-Culture Medium of Cordyceps ramosa and Composition Analysis of Mycelium

LIN Min,SONG Bin,HUANG Hao,LI Ting,SHEN Ya-heng
(Guangdong Institute of Microbiology,Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology(Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base),Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology,South China,Guangzhou 510070,China)

Effects of carbon and nitrogen sources on the optimization of liquid-culture medium for Cordyceps ramosa mycelial biomass,and the optimum liquid medium screening by the orthogonal design,and the main components of mycelium were analyzed．The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources were glycerol and KNO3respectively,and the optimal medium were glycerol 35 g·L-1,KNO312 g·L-1,yeast extract fermentation 12 g·L-1,malt extract 10 g·L-1and H2O 1 L．The mycelium contained crude protein (32．9%),crude fat(1．2%)and ash (5．89%)．The contents of adenosine,polysaccharide, and cordycepic acid were 0．805%,5．89%and 5．61%．And 17 kinds of amino acids(23．97%)were detected from the mycelium．The microelement levels,such as Fe,Mn,Cu,Zn,Se,were 76．70 mg·kg-1,5．10 mg·kg-1,3．7 mg·kg-1,33 mg·kg-1and 0．176 mg·kg-1,respectively．Levels of the heavy metals,such as Pb,As and Hg,met the edible fungus safety standard levels specified by the Ministry of Health of the People’s Republic of China．The results could provide important way for the development and utilization of C.ramosa．

Cordyceps ramosa;liquid medium;orthogonal design;components analysis

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0017-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．004

广东省科技项目（2011B020303003）；广东省科技成果转化项目（2012NL031）；广州市科技项目（201300000031）；中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室项目（SKLM 2013-2015）。

林敏（1983-），女，本科，助理研究员，主要从事真菌资源开发利用研究。E-mail:397003483@qq．com

**通信作者：宋斌（1964-），男，本科，研究员，主要从事真菌资源多样性研究。E-mail:ganoderma@vip．163．com

2015-08-30