紫锥菊多糖对内毒素血症小鼠炎症的保护作用

李艳云，史秋梅，王晓珊，卢会鹏，高光平，张艳英，高桂生，赵惠媛，沈 萍

(河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛，066600)



紫锥菊多糖对内毒素血症小鼠炎症的保护作用

李艳云，史秋梅，王晓珊，卢会鹏，高光平，张艳英，高桂生，赵惠媛，沈 萍

(河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛，066600)

为确定紫锥菊多糖对内毒素血症小鼠炎症反应的保护作用，将100只BALB/c小鼠随机分成正常组，模型组，紫锥菊多糖高、中、低剂量组(分别为2.0，1.0，0.5 g/kg)，每组20只。模型组、紫锥菊多糖各组小鼠通过腹腔注射脂多糖(8 mg/kg)造模，正常组小鼠腹腔注射等量生理盐水。紫锥菊多糖分别于造模前灌胃给药 5 次(间隔 24 h)并在造模后持续给药2次(间隔 24 h)；正常组和模型组小鼠只灌服等体积生理盐水。各实验组小鼠分别于造模后1，6，24，48 h剖杀，ELISA法检测血清中的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β( Interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6 ( Interleukin-6，IL-6)的浓度和肺脏组织的湿质量/干质量值。结果表明：紫锥菊多糖组小鼠的血清中TNF-α，IL-1β，IL-6浓度明显低于模型组(P<0.05)，肺脏组织的湿质量/干质量值明显低于模型组(P<0.05)，且紫锥菊多糖高剂量组小鼠的效果最好。因此，紫锥菊多糖能够为内毒素血症小鼠炎症提供保护作用。

紫锥菊；内毒素血症；肿瘤坏死因子；白细胞介素

紫锥菊是原产于美洲的一类菊科野生花卉，是世界闻名的“免疫”草药，紫锥菊属 (EchinaceapurpureaMoenck )植物共有8个种及数个变种，均为多年生草本，其中紫锥菊Echinaceapurpurea、狭叶紫锥菊Echinaceaaugustifolia和白紫锥菊Echinaceapallida可作为药用。此3种紫锥菊提取物具有突出的抗感染与免疫促进作用，由其组成的各种制剂是当前国际上广泛应用的免疫促进剂。研究表明，紫锥菊可通过刺激机体的免疫系统而增强机体对细菌和病毒感染的抵抗力[1]。

笔者通过对内毒素血症小鼠模型炎症反应的研究，探讨紫锥菊提取物能否为内毒素血症小鼠提供保护作用，从而为畜禽生产中对抗内毒素血症提供可行性理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

6～8周龄20～25 g的BALB/c小鼠引自北京实验动物研究中心，紫锥菊多糖(多糖的质量分数为0.94，紫锥菊多酚的质量分数为0.04，菊苣酸的质量分数为0.02)引自南京泽朗医药科技有限公司，LPS (脂多糖、内毒素)(E.ColiO55:B5，货号L6529，Sigma产品，引自上海前尘生物科技有限公司， 小鼠TNF-α，IL-1β，IL-6定量分析酶联免疫检测试剂盒引自上海巧伊生物科技有限公司。

1.2 分组及造模

将BALB/C小鼠100只，分别随机分成正常组，模型组，紫锥菊多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组等共5组，每组20只，均为公母各半，饲养于干燥、通风、安静的环境，自由饮水，饲料喂养。实验开始前，在实验环境中饲养1 周。将紫锥菊多糖稀释成合适浓度，使紫锥菊多糖高、中、低药物组每只小鼠灌服紫锥菊的总量为2.0，1.0，0.5 g/kg。模型组、紫锥菊多糖组小鼠通过腹腔注射 LPS(8 mg/kg)造模，正常组小鼠腹腔注射等量生理盐水。紫锥菊多糖各组小鼠分别于造模前灌胃给予紫锥菊多糖5次(间隔24 h)，并在造模后持续给予紫锥菊多糖2次(间隔24 h)；正常组和模型组小鼠只灌服等体积生理盐水。各实验组小鼠分别在造模后1，6，24，48 h剖杀，不同时间点每组每次5只。

1.3 血清细胞因子检测

摘眼球取血，血液经自然凝固后，3 000 r/min离心15 min，分离血清。严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作，检测血清中的细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6的质量浓度。

1.4 肺脏组织湿质量/干质量值的检测

颈椎脱臼处死小鼠后，迅速剖开取出完整的一片肺叶，用PBS清洗2次，并用滤纸小心吸干表面水分后称量其湿质量。然后放置在70 ℃恒温箱中烘干48 h至恒质量后，称量其干质量，计算湿质量/干质量值，该比值代表了肺脏的水含量，以此衡量肺脏的水肿情况。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件处理，数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 血清中TNF-α，IL-1β，IL-6细胞因子的检测结果

LPS注射后的各个时间点中，模型组小鼠的TNF-α，IL-1β，IL-6质量浓度都显著高于正常组的(P<0.05)，也显著高于紫锥菊多糖各个剂量组的(P<0.05)(图1～图3)。紫锥菊多糖各组小鼠的TNF-α，IL-1β，IL-6质量浓度与正常组的相比，低剂量组小鼠在1，6，24 h时间点上，这3种细胞因子的质量浓度均显著高于正常组小鼠的(P<0.05)，在48 h时间点上与正常组小鼠的差异不显著(P>0.05)；中剂量组小鼠的3种细胞因子的质量浓度在1，6 h时间点上与正常组小鼠的差异均显著(P<0.05)；而在24 h时间点上，除IL-1β的质量浓度与正常组小鼠的差异显著(P<0.05)外， TNF-α和IL-6的质量浓度与正常组小鼠的差异不显著(P>0.05)；而高剂量组小鼠在各个时间点，这3种细胞因子的质量浓度与正常组小鼠的相比差异均不显著(P>0.05)。由此可见，紫锥菊多糖高剂量组在炎症前期就能显著抑制这些细胞因子，紫锥菊多糖中、低剂量组前期的效果不大明显，48 h时也能显著抑制这些细胞因子。

图2 LPS注射后小鼠血清中IL-6的质量浓度 图3 LPS注射后小鼠血清中IL-1β的质量浓度

2.2 肺脏组织湿质量/干质量值的测定结果

在各时间点，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肺脏水肿程度均显著升高(P<0.05)(表1)；紫锥菊多糖各剂量组小鼠中，低剂量组小鼠在1，6，24 h时间点与正常组小鼠相比水肿程度差异显著(P<0.05)，中剂量组小鼠在6，24 h时间点与正常组小鼠相比水肿程度差异显著，而在48 h时低剂量组小鼠和中剂量组小鼠与正常组小鼠相比水肿程度差异均不显著(P>0.05)，而各时间点高剂量组小鼠与正常组小鼠间水肿程度差异均不显著(P>0.05)；各时间点紫锥菊多糖各剂量组小鼠与模型组小鼠相比，水肿程度差异均显著(P<0.05)。实验结果表明：模型组小鼠肺脏水肿湿质量/干质量值明显高于正常组，而紫锥菊多糖各组小鼠的肺脏水肿程度明显降低，紫锥菊多糖各剂量组小鼠在每个时间点的测量值都更接近于正常水平，尤其紫锥菊多糖高剂量组小鼠的表现最为明显，中、低剂量组的效果稍差。由此可知，紫锥菊多糖在高剂量时能够明显降低由脂多糖诱导的小鼠肺脏水肿的程度。

表1 小鼠肺脏组织湿质量/干质量值测定结果(均数±方差，n=5)

3 结论与讨论

目前已经得到证实，内毒素是动物内毒素血症死亡的主要原因[2]。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分，当细菌裂解时LPS被释放出来。LPS具有很强的致炎作用，可激活多种炎性细胞，使其释放各种炎症介质和细胞因子，而过多的内毒素进入血液后形成内毒素血症，进而引起全身性炎症反应综合症(SIRS)，甚至导致休克及多器官功能障碍综合症(MODS)[3]。

动物机体内不论是经过滴鼻感染，还是经注射脂多糖，在受到病原微生物感染后，机体发生炎症反应，释放如 TNF-α，IL-1β，IL-6等促炎症因子。TNF-α，IL-1β，IL-6是具有多种生物活性的重要前炎症细胞因子，在炎症反应中起至关重要的作用。这些因子协助调节非特异性免疫反应，但当这些因子累积产生时，会导致全身炎症反应综合征、严重的组织损伤等[4,5]；过量产生时，就会导致体内细胞因子释放的“级联反应”，加重细胞损伤，引发急性的内毒素血症，从而导致组织破坏、器官衰竭、休克甚至死亡[6,7]。此过程在内毒素血症发展至SIRS/MODS过程起重要作用[8]，但当机体的免疫系统发挥作用后，这些因子的浓度又会降低。

TNF-α主要由巨噬细胞产生，并通过特异性细胞膜连接受体发挥作用。巨噬细胞在LPS的作用下能够合成并释放TNF-α等多种细胞因子[9]。研究显示，在LPS诱导败血症约1 h就会产生TNF-α[10]。炎症损伤的部位会有大量的TNF-α积聚，说明TNF-α具有很强的促炎作用[11]。同时，它能够诱导炎症的级联反应，经常与IL-1β协同作用[12]。IL-1β是另一重要的促炎因子，由LPS激活的外周血单核细胞主要分泌IL-1β。它能促使T细胞和B细胞增殖分化以及促发炎症和全身反应等。IL-6主要来源于血液中活化的单核巨噬细胞[13]。当IL-6 的表达水平处于正常状态，它可以抑制巨噬细胞分泌 TNF-α和IL-1。但在大量脂多糖的刺激下，IL-6 的表达明显高于机体正常水平，这时，它们不但不能保护机体，反而会加剧炎症。

本次实验通过小鼠腹腔注射LPS构建内毒素血症模型，研究灌服紫锥菊多糖后，小鼠血清中的炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平和肺脏水肿程度。通过实验结果可以发现，小鼠灌服紫锥菊多糖在2.0 g/kg水平时，能够明显抑制这些炎症因子和肺脏水肿程度；当小鼠灌服紫锥菊多糖在1.0 g/kg和0.5 g/kg水平，大约在48 h时，也能明显抑制这些炎症因子和肺脏水肿程度。从一定程度上可以说明紫锥菊多糖能够为患内毒素血症的动物提供保护作用，但是，紫锥菊多糖对内毒素血症的作用机理还需进一步研究。

[1] Percival S S.Use of Echinacea in medicine[J].Biochemical pharmacology,2000,60(2):155-158.

[2] 谷鸿喜，陈锦英.医学微生物学[M].北京：北京大学医学出版社，2003.

[3] 施孟如，南超，徐丽艳，等.TRPV1激活对内毒素血症小鼠肺组织炎症损伤的影响及机制[J].中国病理生理杂志，2013，29(12)：2 223-2 228.

[4] Shimazu R,Akashi S,Ogata H,et al.MD-2,a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4[J].Journal of Experimental Medicine,1999,189(11):1 777-1 782.

[5] Hawkins D L,Mackay R J,Mackay S L,et al.Human interleukin-10 suppresses production of inflammatory mediators by LPS-stimulated equine peritoneal macrophages[J].Veterinary Immunology & Immunopathology,1998,66(1):1-10.

[6] Bone R C.The sepsis syndrome:definition and general approach to management[J].Clin Chest Med,1996,17(2):175-181.

[7] Astiz M E,Rackow E C.Septic shock[J].Lancet,1998,351(9 144):1 501-1 505.

[8] 范少光，丁桂凤.神经内分泌与免疫系统之间相互作用的介导物质：共用的生物学语言[J].生理科学进展，1995，26(2)：175-183.

[9] 张伟，蒋耀光，李磊.肺泡巨噬细胞与急性肺损伤[J].创伤外科杂志，2003，5(5)：389-391.

[10] Cohen J.The immunopathogenesis of sepsis[J].Nature,2002,420(6 917):885-891.

[11] Balkwill F.Tumour necrosis factor and cancer[J].Nature Reviews Cancer,2009,9(5):361-371.

[12] Kolb M,Margetts P J,Anthony D C,et al.Transient expression of IL-1β induced acute lung injury and chronic repair leading to pulmonary fibrosis[J].Journal of Clinical Investigation,2001,107(12):1 529-1 536.

[13] 马丽梅，郑春兰，马加庆.急性肺损伤与细胞因子相关性的研究进展[J].Medical Recapitulate，2009，15 (19)：2 909-2 912.

Protective Effects ofEchinaceapurpureaon Inflammation in Endotoxemia Mice

LI Yan-yun,SHI Qiu-mei,ZHAO Hui-yuan,WANG Xiao-shan,LU Hui-peng,GAO Guang-ping,ZHANG Yan-ying,GAO Gui-sheng, SHEN Ping
(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinghuangdao Hebei,066600,China)

This paper is to study the inflammation protection ofEchinaceapurpureain endotoxemia mice. 100 Balb/c mice were randomly divided into normal group and model group, echinacea high, medium and low dose (2.0,1.0,0.5 g/kg) group,twenty mice for each group. Model group and echinacea purpurea polysaccharide group mice were induced by abdominal cavity injection of endotoxin (8 mg/kg).Normal group mice were injected equal volume physiological saline. Before establishment of the mice model,Echinaceapurpureapolysaccharide group mice were filled the stomach five times before the model and two times after the model(interval 24 h). Normal group and endotoxemia group mice were filled the stomach equal volume physiological saline. The mice were killed after establishment of the mice model on 1,6,24,48 hour. Cytokines of TNF-α,IL-1β and IL-6 were detected by ELISA. In addition, the proportion of wet wight/dry wight in lung tissue were detected. Results showed that concentration of TNF-α,IL-1β,IL-6 and the proportion of wet wight/dry wight in endotoxemia mice increased significantly than the other group.Echinaceapurpureacan protect the inflammation of endotoxemia mice.

EchinaceapurpureaPolysaccharide; endotoxemia; tumor necrosis factor; interleukin

国家自然科学基金资助项目(项目编号：31472230)；河北省自然科学基金资助项目(项目编号：C2014407068)；河北省科技厅科技支撑计划项目(项目编号：14966610D，12220408D)；石家庄市科技局科技支撑计划项目(项目编号：131200063A)；河北省教育厅百名优秀创新人才支持计划(Ⅱ)项目(项目编号：ZH2011244，Q2012037)。

2015-01-19;修改稿收到日期：2015-06-12

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.002

S816.7

A

1672-7983(2015)03-0008-04

李艳云(1986-)，女，在读硕士研究生。主要研究方向：动物病原微生物与动物传染病。

(责任编辑：朱宝昌)

*通讯作者，女，教授。主要研究方向：动物传染病学。E-mail:shiqiumei@126.com。