槲皮素对糖尿病大鼠肾脏保护机制的研究*

常陆林，刘春杰，王兴红△，李海霞

(1.漯河医学高等专科学校基础医学部，河南漯河 462000; 2.新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054)

槲皮素对糖尿病大鼠肾脏保护机制的研究*

常陆林1，刘春杰1，王兴红1△，李海霞2

(1.漯河医学高等专科学校基础医学部，河南漯河 462000; 2.新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054)

目的:观察槲皮素对糖尿病大鼠肾脏的保护作用并初步探讨其作用机制。方法:制备糖尿病大鼠模型，按随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组以及槲皮素组，8周后测定各组大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白、肾脏肥大指数、肾内超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量;Western blot测定肾内单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量，酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)，光镜观察肾小球病理形态学变化。结果:与模型组比较，槲皮素组大鼠血BUN、Scr、24 h尿蛋白、肾脏肥大指数、血清IL-6、TNF-α、hs-CRP，PAI-1及肾内MDA和MCP-1表达均明显降低，肾内SOD活力明显升高，且明显改善肾小球病理变化。结论:槲皮素能改善糖尿病早期肾功能，其机制可能与改善氧化应激和抗炎的作用有关。

糖尿病肾病;槲皮素;单核细胞趋化蛋白-1;氧化应激;炎症

目前，糖尿病肾病(DN)是国内外糖尿病患者的严重微血管病并发症之一，其发病机制和有效防治措施一直是医学界研究的焦点。近年来，不少学者在探索DN的病因时提出了“炎症发病机制”和抗炎治疗措施。槲皮素(Quercetin，Que)是一种天然的黄酮类化合物，因其具有广泛的药理作用而愈来愈受到人们的重视，是具有多靶点作用和综合治疗优势的中药单体。本课题组既往研究Que对缺血再灌注损伤心肌具有抗氧化抗炎的保护作用［1］。有研究表明［2］，Que对大鼠慢性肾功能衰竭具有防治作用，但机制尚未明确，我们推测它对DN可能有防治作用。本研究旨在观察Que对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠氧化应激和炎症影响，揭示其是否对DN有保护作用，进一步为Que防治DN的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 成年清洁级健康雄性SD大鼠，体质量300～350 g，由河南省实验动物中心提供(合格证号410117)。

1.1.2 药物和试剂 槲皮素(批号100123，美国Sigma公司);链脲佐菌素(批号090412，美国Sigma公司);丙二醛(批号091103)、超氧化物歧化酶(批号091221)、白细胞介素6 ELISA试剂盒(批号090211)、超敏C反应蛋白ELISA试剂盒(批号090111)、纤溶酶原激活物抑制剂1 ELISA试剂盒(批号080211)均购自南京建成生物工程研究所;肿瘤坏死因子 αELISA试剂盒(批号 090521，德国Siemens公司);MCP-1小鼠抗大鼠单克隆抗体(批号100911，美国 Santa Cruz公司);β-actin(批号100122，北京博奥森生物公司)。

1.1.3 主要仪器 三诺SXT-1型快速血糖测定仪(长沙)，UV-7501紫外分光光度计(无锡科达仪器厂)，全自动酶联免疫吸附仪(芬兰 Thermo Labsytom)，CM1900-1-1恒冷箱冰冻切片机(德国Leica)，倒置光显微镜(德国 Leica)，Power-pac200电泳仪(美国BIO-RAD公司)，Trans-Blot电泳湿转仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分组与给药 成年健康雄性SD大鼠30只适应性喂养1周后，随机抽取20只称量体质量，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg。注射前动物禁食12 h，不禁水。注射后48 h尾静脉取血测定血糖，以血糖≥16.65 mmol/L为糖尿病大鼠。余10只正常对照组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。实验大鼠按随机数字表法分为正常对照组(A)、糖尿病模型组(B)和槲皮素组(C)(50 mg/kg· d，临用前用生理盐水配成含槲皮素10 g/L的溶液)灌胃治疗8周。正常组和糖尿病模型组按体质量换算等体积生理盐水灌胃8周。全部大鼠常规饲料喂养，自由饮水。在实验过程中由于模型组2只大鼠因高血糖死亡，最终28只完成实验，其中正常对照组10只，模型组8只，槲皮素组10只。

1.2.2 标本采集与处理 实验结束前1 d大鼠置代谢笼内收集24 h尿并计算尿量;动物麻醉称重，心脏采血，离心后-70℃保存备用;并立即处死大鼠，剖腹取双侧肾脏标本，用滤纸吸干水分去包膜、称重，计算肾脏肥大指数(肾脏肥大指数=双侧肾质量/体质量×%)。右肾-70℃冻存备用;左肾固定、石蜡包埋，做4 μm厚度非连续切片，进行HE染色，光镜下观察肾小球病理形态学变化。

1.2.3 血糖测定 尾静脉取血后采用快速血糖仪测定。

1.2.4 血BUN、Scr及24 h尿蛋白测定 用OLYMBUSAU-600全自动生化分析仪测BUN、Scr，采用双缩脲法测定24 h尿蛋白含量，以上均由漯河市中心医院检验科测定。

1.2.5 血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1检测

取已备血清，通过自动酶免分析仪测定血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1水平，在550 nm光下读取OD值，应用标准曲线计算含量。操作严格按照相应的ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.6 肾组织MDA、SOD检测 取右肾用冰冷生理盐水清理血迹，用滤纸吸干，取组织约150 mg，置于2.0 mL玻璃匀浆器中制备10%的组织匀浆，离心(2500 r·min-1离心10 min)取上清放置4℃备用。MDA、SOD测定应用紫外分光光度计，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.7 Western blot测定肾脏内MCP-1的含量

取右肾组织用苯甲基磺酰氟摄取蛋白质，用BCA法测定总蛋白含量。蛋白样品行10%SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上封闭，加入一抗［MCP-1小鼠抗大鼠单克隆抗体(1∶1000)］，4℃过夜，倾去一抗，TBST洗膜3次，每次15 min。洗涤后二抗孵育［羊抗小鼠抗体(1∶5000)］，置于摇床上摇动，室温下1 h弃去二抗，TBST洗膜3次，每次15 min;ECL发光剂暗室曝光成像、拍照，IMAGE J软件分析求得平均光密度值(IOD)。

1.2.8 统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

与正常对照组大鼠比较，建立的糖尿病模型大鼠出现多饮、多尿、多食的症状，毛发色泽黯淡，精神萎靡，活动减少，随着病程延长，除大鼠体质量呈下降趋势外，其他症状更加明显;与糖尿病模型组比较，槲皮素治疗8周后，上述症状体征得到改善。

2.2 HE染色观察肾小球病理形态学

图1显示，正常对照组肾小球大小较一致，肾小球结构清晰，基底膜未见明显增厚，系膜区基质未见增多，系膜细胞及内皮细胞未见增多，符合正常大鼠处死后的肾小球结构特点;糖尿病模型组肾小球体积增大呈分叶状，肾小球血管壁可见玻璃样变性，基底膜轻度增厚，系膜基质轻度增多;槲皮素治疗8周后肾小球体积减小，血管壁变性减轻，细胞形态基本正常，较模型组病理改变明显减轻。

图1 各组大鼠肾小球病理形态学变化(HE染色，×400)

2.3 血BUN、Scr、24 h尿蛋白、肾脏肥大指数

表1显示，与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血BUN、Scr、24 h尿蛋白、肾脏肥大指数显著升高(P＜0.05或P＜0.01);与模型组比较，槲皮素组大鼠血BUN、Scr、24 h尿蛋白、肾脏肥大指数显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 药物干预8周不同组别血BUN、Scr、24 h尿蛋白、肾脏肥大指数比较

2.4 血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1含量

表2显示，与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1含量显著升高(P＜0.05或P＜0.01);与模型组比较，槲皮素组大鼠血清上述炎症因子显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 药物干预8周不同组别血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1含量比较

2.5 肾组织MDA、SOD含量

表3显示，与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠MDA水平显著升高(P＜0.05)，SOD活性显著降低(P＜0.01);与模型组比较，槲皮素组大鼠MDA水平显著降低(P＜0.01)，SOD活性显著升高(P＜0.05)。

表3 药物干预8周不同组别肾组织MDA、SOD含量和MCP-1蛋白表达比较

2.6 Western blot检测MCP-1肾组织蛋白表达

图2表3显示，与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠肾内MCP-1蛋白表达显著升高(P＜0.01);与模型组比较，槲皮素组大鼠肾内MCP-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)。

图2 各组大鼠肾脏MCP-1蛋白表达的变化(Western blot检测)

3 讨论

目前糖尿病肾病(DN)的发病机制尚未阐清，在已知DN发生发展的病理生理机制中，氧化应激和炎症反应均起着十分重要的作用［3］。肾脏是氧化应激高度敏感的器官之一。越来越多的研究表明，在糖尿病状态下，肾组织中氧化应激水平和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达呈明显相关关系，肾组织中过量产生的活性氧簇(ROS)可能是MCP-1高表达的刺激因素。MCP-1为目前DN炎症发病机制学说中研究的热点和焦点，具有发动炎症反应、促进肾小球系膜细胞增生、介导单核细胞产生细胞因子、表达黏附分子等多种生物效应。MCP-1可促进白细胞介素-1、6(IL-1和IL-6)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)等炎症介质的释放;引发氧化应激，激活蛋白水解酶，增加氧自由基的生成，损伤血管内皮细胞;激活单核细胞加剧炎症，刺激系膜细胞分泌Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白导致肾小球硬化［4-5］，因此干预MCP-1表达已成为治疗DN的重要手段。目前研究认为，炎症因子已成为DN持续发展过程中的重要危险因素［6］。本研究也证实，糖尿病模型大鼠循环血中炎症因子 IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1和肾组织中MCP-1蛋白表达增多。经Que治疗后，大鼠肾组织中MCP-1蛋白表达和血清炎症因子IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1明显降低，提示Que对糖尿病状态下的低度炎症反应有明显的抑制作用，显示其抗炎作用。

DN因其高致残率和高致死率一直是医学界研究防治的热点。近10多年来，我国中医药界广泛开展了中医药防治DN的研究，并逐渐显示出较大的潜力和广阔的应用前景［7］。Que是一种天然的黄酮类化合物，存在于多种植物的花、叶、果实中，具有抗氧化、抗炎、抗黏附、抗血栓、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂、降低血压以及免疫调节作用［8-9］。课题组前期研究Que可以降低肾组织MDA含量，提高SOD活力并减少BUN、Scr、24 h蛋白尿，抑制肾内一氧化氮合酶活性和NO水平，抑制糖尿病肾脏早期的高灌注、高滤过，延缓DN的发生发展，发挥保护糖尿病肾脏的作用［10］。高糖环境下，氧化应激和炎症反应在DN的进展中互为因果关系，加重肾脏的损害。本研究在前期研究基础上进一步探讨Que对DN保护作用机制。Que作为一种有效的抗氧化和抗炎剂，对DN的发展起到一定的抑制作用，其机制很可能是通过抑制氧化应激、增强抗氧化能力，从而抑制肾内MCP-1的表达。MCP-1可以促进循环血中炎症因子IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1等的释放。本研究显示，Que能抑制以上炎症因子的水平，我们推测这种抑制改变可能是Que通过抑制肾内MCP-1的表达从而降低肾组织低度炎症反应，发挥抗纤维化作用，从而产生对肾组织和肾功能的保护作用。综上研究提示，对于糖尿病肾损伤大鼠，Que可能通过改善氧化应激和抗炎的作用机制，发挥对早期DN的保护作用。Que有望成为DN防治的有效药物，其临床疗效和具体的作用途径还有待于进一步的验证和研究。

［1］王兴红，郑亚萍，李海霞.槲皮素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(4):266-270.

［2］李列平，李雄，彭自全，等.槲皮素对大鼠慢性肾功能衰竭及促红细胞生成素水平的影响［J］.中国医院药学，2004，24 (7):412-413.

［3］Stanton RC.Oxidative stress and diabetic kidney disease［J］.Curr Diab Rep，2011，11:330-336.

［4］Woolf AS，Gnudil，Long DA.Roles of angiopoietins in kidney development and disease［J］.Am Soc Nephrol，2009，20(2): 239-244.

［5］JA Jefferson1，SJ Shankland，RH Pichler.Proteinuria in diabetic kidney disease:A mechanistic viewpoint［J］. Kidney International，2008，74:22.

［6］Arumugam S，Thandavarayan RA，Arozal W，et al.Quercetin offers cardioprotection against progression of experimental autoimmune myocarditis by suppression of oxidative and endoplasmic reticulum stress via endothelin-1/MAPK signalling［J］.Free Radic Res，2012，46(2):154-163.

［7］尹娟娟，尹登科.中药改善糖尿病肾病蛋白尿作用机制的研究进展［J］.时珍国医国药，2012，23(8):2002-2005.

［8］奉水旺，杨丽，王攀攀，等.ERK信号通路在槲皮素促大鼠MSCs成骨分化中的作用［J］.中国病理生理杂志，2012，28 (8):1477-1481.

［9］张禁，谭诗云，蒋琳，等.槲皮素对大鼠酒精性脂肪肝核转录因子表达的影响［J］.世界华人消化杂志，2007，15(22): 2399-2402.

［10］王兴红，郑亚萍，魏芳.槲皮素对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠氧自由基和一氧化氮的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(5):244-247.

Protective Mechanism of Quercetin on Kidney in Diabetic Rats

CHANG Lu-lin1，LIU Chun-jie1，WANG Xing-hong1△，LI Hai-xia2
(1.Luohe Medical College，Henan，Luohe 462000，China; 2.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

Objective:To observe the protective role of Quercetin on diabetic rats’kidney and explore its mechanism.Methods:The model of diabetic rats was made.The rats were randomly divided into three groups:normal group，diabetic model group，and Quercetin group.The serum creatinine(Scr)，blood urea nitrogen(BUN)，24 h urine protein，kidney hypertrophy index，the vitality of superoxide dismutase(SOD)and the content of malondialdehyde(MDA)in kidney of each group were measured.The monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1)was measured by western blot.The serum interleukin 6(IL-6)，tumor necrosis factor(TNF alpha)，hypersensitive c-reactive protein(hs-CRP)and fibrinolytic enzyme activators inhibitor 1(PAI-1)were detected with the ELISA method.Results:Compared with the model group，the BUN，Scr and 24 h urine protein，and kidney’s hypertrophy Index of the serum of the rat in Quercetin group were significantly reduced.The IL-6，TNF-α，hs-CRP，PAI-1，MDA in the kidney，MCP-1 protein were significantly reduced，and SOD’s viability was significantly lowered，so the differences were statistically significant，and the glomerular pathological morphology was significantly improved.Conclusion:Quercetin can improve earlier diabetic kidney，and its mechanism may be related to improve oxidative stress and anti-inflammatory effect.

Diabetic nephropathy;Quercetin;MCP-1;Oxidative stress;Inflammation

R587.1

:B

:1006-3250(2015)07-0816-03

2015-03-04

漯河医学高等专科学校校级自然科学研究资助项目(2013-S-LMC24);河南省教育厅高等学校重点科研项目(15B180011)

常陆林(1979-)，男，湖北宜昌人，讲师，医学硕士，从事黄酮类化合物药理活性研究。

△通讯作者:王兴红(1981-)，女，山东临沂人，讲师，医学硕士，从事糖尿病肾病的发病机制与防治研究，Tel: 15839575585，E-mail:xinghong0124@163.com。