天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块内MMP-9和TIMP-1表达的影响*

马文慧，安冬青，古丽加玛力·尼亚孜，耿 冲

(新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 830011)

天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块内MMP-9和TIMP-1表达的影响
*

马文慧，安冬青△，古丽加玛力·尼亚孜，耿 冲

(新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 830011)

目的:观察天香丹对As秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块病理变化、MMP-9及TIMP-1表达的影响，探讨天香丹对As秽浊痰阻证斑块稳定性的影响及其机制。方法:将12只ApoE-/-小鼠正常对照组以普通饲料喂养，36只ApoE-/-小鼠以高脂饲料复合寒燥环境喂养12周，构建As秽浊痰阻证模型，造模成功后按随机数字表法分为天香丹组、阿托伐他汀组、模型组。12周后处死、HE染色测定PA/LA比值，免疫组化检测MMP-9及TIMP-1的表达。结果:与正常对照组比较，模型组的PA/LA比值上升，斑块内MMP-9比值上升，TIMP-1比值下降。与模型组比较，天香丹组、阿托伐他汀组PA/LA比值减小，斑块内MMP-9比值下降，TIMP-1比值上升。结论:天香丹可有效降低As秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠PA/LA的比值，降低斑块内MMP-9水平的表达，增加TIMP-1水平表达，从而抑制胶原纤维分解，对As秽浊痰阻证斑块具有稳定性作用。

动脉粥样硬化;天香丹;秽浊痰阻证;MMP-9;TIMP-1;

动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)严重危害人类健康，是缺血性心脑血管疾病的病理基础。As的基本病变是动脉内膜的脂质沉积、内膜灶状纤维化、粥样斑块形成，致管壁变硬、管腔狭窄，引起相应器官缺血性改变［1］。新疆地处我国西北部，气候干燥寒冷，居民多喜食肥甘厚腻之品。肥甘易伤脾胃，使运化失常，脾虚湿盛，燥伤津液，炼液成痰;痰邪凝结成块，壅滞脉络;寒邪入侵，气机闭塞，则血运不畅，瘀血内生，演变成以脾虚为本、痰瘀湿浊为标的秽浊痰阻证［2］。ApoE能够抑制细胞外基质的基因表达，从而维持动脉的弹性，减轻动脉硬化［3］。ApoE基因缺陷小鼠由于ApoE基因敲除后，造成血浆含胆固醇丰富的残粒清除受阻，可出现高胆固醇血症，并自发地形成纤维斑块和复合斑块，是进行AS发病机制和防治研究可靠的动物模型。前期课题组根据新疆特殊的气候环境和饮食习惯已成功建立了As秽浊痰阻证模型［4］。天香丹由新疆地产中药蔷薇红景天、维吾尔药唇香草及中药丹参等组成。本研究拟通过建立As秽浊痰阻证动物模型基础上研究天香丹对As秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块内MMP-9和TIMP-1表达的影响，旨在进一步揭示其稳定斑块的作用机制，为临床治疗AS病变提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性ApoE-/-小鼠48只，8周龄，体质量(18±2)g，购自北京大学医学部动物实验室(动物质量合格许可证号SCXK(京)2011-0012)，饲养于新疆医科大学第一附属医院医学动物实验中心。

1.2 实验用药

天香丹颗粒(新疆医科大学附属中医院制剂室制备)，阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司)。

1.3 仪器及试剂

202-2AB型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，BIC400人工气候箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，LEICADM2500光学显微镜(德国)，胆固醇(美国AMRESCO公司)，猪胆盐(上海蓝季科技发展有限公司)，兔抗MMP-9多克隆抗体、兔抗TIMP-1多克隆抗体(武汉博士德)。

1.4 模型制备

将12只ApoE-/-小鼠正常对照组以普通饲料喂养，36只ApoE-/-小鼠以高脂饲料复合寒燥环境喂养12周构建As秽浊痰阻证模型。喂养12周后，按随机数字表法从正常组抽取2只，造模组抽取6只ApoE-/-小鼠进行主动脉组织标本检查，模型组ApoE-/-小鼠生物表征见行动迟缓、抑郁状态、进食较少、舌质多见暗红或暗紫色，病理见大量粥样斑块形成、管腔明显狭窄，可见少量泡沫细胞、大量胆固醇结晶形成，证实As秽浊痰阻证模型制备成功。

1.5 分组及给药

将模型组30只ApoE-/-小鼠按随机数字表法分为天香丹组2.7g/(kg·d)、阿托伐他汀组6.1mg/ (kg·d)，模型组给予蒸馏水0.2ml/d，药物干预组剂量均根据成人临床常规用量等效换算，小鼠实验用量g/(kg·d)=9.1×成人临床用量g/(kg·d)，将临床用量换算为动物实验用量［5］，药物溶于蒸馏水，灌胃给药每日1次，继续喂养12周。每周按体质量调整药物用量，正常对照组、模型组均给予蒸馏水0.2ml/d，正常对照组给予普通饲料喂养，置于室温20～24℃、相对湿度40%～70%环境中;各组小鼠均自由饮水饮食，不限制活动。高脂饲料配方:基础饲料 72.5%，猪油 10%，蔗糖 10%，猪胆盐0.2%，胆固醇2%，丙硫氧嘧啶0.12%，蛋黄5%，21金维他0.1%。人工气候箱系统温度设定为6℃± 2℃，相对湿度控制在25%～32.8%。

1.6 指标检测与方法

1.6.1 取材 实验前期1周观察小鼠活动、进食、水量、体质量、外观毛色、活动等情况，待小鼠活动、粪便等均未见异常进行实验。于灌胃12周后处死小鼠，分离主动脉瓣至髂肾动脉分支动脉组织，在相同部位取一段长约1cm的主动脉，由4%多聚甲醛(含0.1%的DEPC)固定。

1.6.2 HE染色及斑块面积分析 常规脱水，用石蜡包埋，每个样本连续切片5um，40张每间5张取1张，共取8张切片，经HE染色后在光镜下观测主动脉形态学变化，用ImageG多功能图像分析软件做形态测量分析。测量指标为血管管腔面积(LA)和粥样斑块面积(PA)，计算粥样斑块面积与管腔面积之比(PA/LA)，取PA/LA均值进行统计学分析。

1.6.3 免疫组化 染色检测斑块内MMP-9和TIMP-1表达。免疫组化:脱蜡、水化组织切片，3% H2O2去离子水孵育5min，PBS冲洗。滴加一抗(1∶100)，37℃孵育2h，PBS冲洗，2min×3次。滴加二抗羊抗兔IgG，室温或37℃孵育20min，PBS冲洗，2min×3次，应用 DAB溶液显色。蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片。每组随机选取5例免疫组化切片，光镜下观察细胞上呈棕色着色者为阳性细胞，每张切片选择阳性目标最多的区域，采取3个视野，结果判定采用ImageProPlus6.0软件图像分析，对MMP-9和TIMP-1的表达进行半定量分析。计算其积分光密度。

1.7 统计学方法

采用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

正常对照组小鼠活泼、反应敏捷，频繁撕咬，皮毛洁净有光泽，其余4组小鼠活动明显减弱，行动迟缓，皮毛无光泽。

2.2 病理形态学观察

正常对照组As各期病变均可见，但多脂纹脂斑期病变，可见由大量泡沫细胞形成，也可见由纤维帽覆盖的纤维斑块期病变及由大量泡沫细胞及胆固醇结晶形成的粥样斑块期病灶。模型组多为AsⅢ期粥样斑块期病灶，表现为主动脉管壁明显厚薄不均匀，以内膜的病变为明显，斑块面积大，纤维帽较薄，可见大量泡沫细胞及胆固醇结晶形成，且脂质核心较大，多数斑块与管壁黏附不紧密，可见脱落，局部钙化，外膜有大量炎细胞浸润。天香丹组As各期变均可见，主要为As纤维斑块期病变，镜下可见主动脉壁、动脉管壁厚薄不均，内膜明显增厚，可见纤维帽覆盖的纤维斑块与管壁黏附紧密，未见有脱落者，纤维帽较厚，脂质核心较小，外膜可见少量炎细胞浸润，斑块稳定性较好。阿托伐他汀组主要为As纤维斑块期病变，动脉管壁厚薄不均，内膜明显增厚，可见纤维帽覆盖的纤维斑块，与管壁黏附尚紧密，未见有脱落者，脂质核心不明显，外膜炎细胞浸润少见。

图1 各组小鼠主动脉根部HE染色及斑块面积(×200)

2.3 斑块面积/管腔面积比值

ApoE-/-小鼠均见As斑块形成，管腔呈不同程度的狭窄。表1显示，与正常对照组比较，模型组小鼠斑块面积/管腔面积比值上升(P＜0.01);与模型组比较，天香丹组、阿托伐他汀组的斑块面积/管腔面积比值明显减小(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块面积的影响(%，±s)

表1 天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块面积的影响(%，±s)

注:与正常对照组比较:＊＊P＜0．01;与模型组比较:#P＜0．05，##P＜0.01

组别 鼠数PA/LA正常对照组80.02±0.35模 型 组 8 0.67±0.19＊＊天 香 组 8 0.17±0.22##阿托伐他汀组 8 0.23±0.26#

2.4 斑块内MMP-9和TIMP-1表达

图2、3表2显示，与正常对照组比较，模型组小鼠斑块内MMP-9积分光密度值上升(P＜0.01)，斑块内TIMP-1积分光密度值下降(P＜0.01)，与模型组比较，天香丹组、阿托伐他汀组斑块内MMP-9积分光密度值下降(P＜0.01)，斑块内TIMP-1积分光密度值上升(P＜0.01)。

图2 各组小鼠斑块内MMP-9的表达(免疫组化染色，×200)

图3 各组小鼠斑块内TIMP-1的表达(免疫组化染色，×200)

3 讨论

MMPs是导致 As斑块不稳定的重要因素之一［6］。在As形成过程中，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)能够降解局部细胞外基质，减少细胞外胶原纤维含量，进而加速斑块破裂。粥样斑块内的胶原含量对于稳定斑块至关重要。斑块内巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶是一类对细胞外基质具有降解活性的蛋白酶超家族，其中MMP-9主要降解细胞外IV型胶原和弹力纤维，使得炎性细胞可以通过基底膜与As斑块稳定性尤为相关。MMP-9是As斑块内巨噬细胞分泌的主要基质金属蛋白酶，可以降解变性的胶原和弹性蛋白，使As斑块纤维帽崩解，有利于平滑肌细胞迁移至内膜使其增厚。其表达增加、活性增强可使斑块稳定性降低，导致斑块破裂［7］。As斑块内同时表达TIMP，拮抗着MMP的活性。As斑块内基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)可限制MMP-9降解基质的作用，从而有利于斑块的稳定而减少冠脉事件发生。

表2 天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块内MMP-9、TIMP-1的表达(±s)

表2 天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块内MMP-9、TIMP-1的表达(±s)

注:与正常对照组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:##P＜0.01

组别 鼠数 MMP9积分光密度 TIMP1积分光密度正常对照组15 429.74±66.13 5039.66±57.65模 型 组 15 5985.38±32.20＊＊ 252.25±35.61＊＊天 香 组 15 664.93±27.66## 4380.61±29.40##阿托伐他汀组 15 2256.08±53.53## 1524.84±58.07##

新疆深居内陆，远离海洋，形成了极端干燥的大陆性气候，如晴天多、日照强、少雨干燥、冬寒夏热、昼夜温差大以及风沙较多等。饮食习惯上少数名族聚集的居民多喜食牛羊肉奶制品。根据新疆特殊的地理环境、气候及居民饮食习惯，建立高脂饲料复合寒燥环境As秽浊痰阻证模型。与正常对照组比较，模型组ApoE-/-小鼠生物表征见行动迟缓、抑郁状态、进食较少、舌质多见暗红或暗紫色，病理见大量粥样斑块形成，管腔明显狭窄，可见少量泡沫细胞，大量胆固醇结晶形成，证实As秽浊痰阻证模型已制备成功。天香丹由新疆地产中药蔷薇红景天、维吾尔药唇香草及中药丹参等组成，结合临床用药的经验，推断天香丹可能具有稳定动脉粥样硬化斑块的作用。他汀类药物不仅降脂，还能抑制炎症细胞浸润及炎症介质释放，减少MMP表达及血栓形成等，使斑块保持稳定。天香丹组在降低斑块面积、下调斑块内MMP-9的表达、上调斑块内TIMP-1的表达方面，与阿托伐他汀组比较差异无统计学意义，提示天香丹作用与阿托伐他汀相当，说明天香丹具有稳定动脉粥样硬化斑块作用。

本实验结果表明，与模型组比较，天香丹组降低动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠斑块面积/管腔面积的比值，降低斑块内MMP-9水平的表达，增加TIMP-1水平表达，从而抑制胶原纤维分解，对动脉粥样硬化秽浊痰阻证斑块具有稳定性作用。后续的研究中将进一步观察天香丹在分子水平上抗秽浊痰阻证动脉粥样硬化的作用机制。

［1］ 李玉林．病理学［M］．北京:人民卫生出版社，2013:8．［2］ 朱萌，安冬青，等．从三焦气化失常探讨新疆冠心病秽浊痰阻证之证型特点［J］．中国实验方剂学杂志，2009，15(5):88-89．

［3］ KothapalliD．LiuSL．BaeYH．etal．Cardiovascularprotectionby ApoEandApoE-HDLlinkedtosuppressionofECM gene expressionandarterialstillening［J］．CellRep，2012，10(12): 322-335．

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EffectofTianxiangdanonExpressionofMMP-9andTIMP-1inAtherosclerosis HuizhuoTanzuSyndromeofApoE-/-mice

MAWen-hui，ANDong-qing△，GuNijiamali-niyazi，GENGChong
(CollegeoftraditionalChinesemedicine，XinjiangMedicalUniversity，XinjiangUrumqi830011，China)

Objective:Toobservethechangesofmatrixmetalloproteinase9(MMP-9)andtissueinhibitorof metalloproteinase1(TIMP-1)ExpressionTianxiangdanPhlegmTurbiditySyndrome(ApoE-/-)，toexploretheeffectand mechanismofTianxiangdanonatheroscleroticplaquestabilityofPhlegmTurbiditySyndrome．Methods:12ApoE-/-micein blankcontrolgroupfedwithnormaldiet，48ApoE-/-micewithconstructatherosclerosisPhlegmTurbiditySyndromemodel werefedwithhighfatforagecompositedryandcoldenvironmentfor12weeks，randomlyselect2micefornormalgroup，and8formexperimentgrouptoconfirmmodelwasmadesuccessfully，Afterthesuccessofmodelingwererandomlydivided intoTianxiangdangroup，atorvastatingroup，modelgroup．Killedafter12Week，theaorticarchHEofmorphological observationandimageanalysiswerestained，plaqueareaandlumenarearatio．ImmunohistochemicalmethodforMMP-9 andTIMP-1detection．Results:After12weeks，comparedwiththeblankcontrolgroup，modelgroup，plaquearea/lumen arearise，plaqueinsidetheMMP-9ratioincreased，TIMP-1ratiodecreased．Comparedwiththemodelgroup，Tianxiangdangroup，atorvastatingroupplaquearea/lumenratiodecreases，plaqueMMP-9integralopticaldensityvalues decreased，TIMP-1integralopticaldensityvaluerise．Conclusion:Tianxiangdangranulecaneffectivelyreducetheratioof atheroscleroticPhlegmTurbiditySyndromeApoE-/-miceplaquearea/lumenarea，reducethelevelsofexpressionof MMP-9plaque，increasethelevelofTIMP-1expression，therebyinhibitingcollagendecomposition，withthestabilityof atherosclerosisplaquePhlegmTurbiditySyndrome．

Atherosclerosis;Tianxiangdan;PhlegmTurbiditySyndrome;MMP-9;TIMP-1

R285．5

:B

:1006-3250(2015)08-0943-03

2015-02-19

国家自然科学基金资助项目(81160428)

马文慧，医学硕士，从事心血管疾病的中医药临床与研究。

△通讯作者:安冬青，教授，医学博士，从事心血管疾病的中医药临床与研究，Tel:0991-4266251，E-mail:andongqing@ sina．cn。