逍遥丸对小鼠卵母细胞BMP-6/Smads通路表达的影响*

杨丽芸，杜惠兰，白 静，孙晓换，范丽洁

(河北中医学院，中西医结合生殖疾病协同创新中心，石家庄 050091)

逍遥丸对小鼠卵母细胞BMP-6/Smads通路表达的影响*

杨丽芸，杜惠兰△，白 静，孙晓换，范丽洁

(河北中医学院，中西医结合生殖疾病协同创新中心，石家庄 050091)

目的:观察逍遥丸对小鼠卵母细胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4表达的影响。方法: 将200只雌性小鼠按随机数字表法分为疏肝高、低剂量组、COH组和空白对照组4组各50只。应用免疫组化和real-time PCR方法分别测定卵母细胞中BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA的表达。结果:与空白对照组比较，COH组BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表达差异无统计学意义，各治疗组BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表达增加，疏肝高剂量组优于低剂量组;疏肝高剂量组BMPR II蛋白和mRNA表达增加。结论:逍遥丸可使BMP-6表达上调，激活其Ⅱ型受体BMPRⅡ形成受体复合物，然后募集Ⅰ型受体ALK-2和ALK-6使其活化，活化的Ⅰ型受体进一步磷酸化细胞内信号Smad1/5/8，然后与Smad4结合，从而启动信号传导干预卵泡发育和卵母细胞的质量。

逍遥丸;卵母细胞;BMPR II;ALK-2;ALK-6;Smad1;Smad5;Smad8;Smad4

目前，不孕症已经成为严重影响育龄夫妇家庭和社会和谐的关键性因素，其发病率日益提高，而卵子质量是影响妊娠结局的重要因素之一。卵泡发育及卵子质量受卵母细胞分泌因子(Oocyte secreted factors，OSFs)的调控，其在调节卵泡的发育和衰退、影响优势卵泡的选择以及闭锁卵泡的形成方面发挥着重要作用。其中卵母细胞分泌的转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员GDF-9与BMP-6通过与Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，与Ⅰ型受体共同作用启动信号传导［1］，而Smads是TGF-β超家族下游信号传导分子，在其信号传导过程中发挥着重要作用。GDF-9和BMP-6及其Smads信号途径对体内卵泡发生发育、卵丘扩散、卵母细胞的成熟至关重要［2-3］。疏肝法治疗不孕症临床疗效显著［4］，本课题前期以逍遥丸作为疏肝法的代表方，研究疏肝法对无排卵模型大鼠生殖功能的影响，证实疏肝法可以通过改善腺垂体、卵巢形态，调节下丘脑神经递质水平以及生殖内分泌激素FSH、LH、E2水平，促进卵泡发育和成熟，并可促进子宫发育、调节子宫内膜环境，以有利于孕卵着床;并发现逍遥丸促进卵泡发育并诱发排卵的机制可能与上调小鼠卵母细胞和体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者卵泡液中生长分化因子-9(GDF-9)的含量有关［5-6］。但对小鼠卵母细胞的研究发现，逍遥丸并未引起GDF-9下游Smads通路的明显变化。而逍遥丸是否同样能调控小鼠卵母细胞中BMP-6的表达，并激活其下游受体及蛋白，启动Smads信号传导，进而影响卵子的发育及质量值得研究。本研究以观察逍遥丸对小鼠卵母细胞BMP-6、相关受体BMPRII、ALK-2、ALK-6及下游 Smads通路中Smad1、Smad5、Smad8和Smad4表达的影响，进一步探讨逍遥丸在促卵母细胞发育中的机制，丰富和完善中医生殖理论。

1 材料

1.1 实验动物

健康雌性清洁级昆明小鼠200只，6～7周龄，体质量28～32 g，购自河北实验动物中心(动物合格证号1207019)。自由饮水和进食，饲养室温度保持在(20±1)℃，相对湿度约50%，自动控制光照12 h，黑暗12 h。

1.2 药物

逍遥丸由河南宛西制药股份有限公司生产(批号120404);将200、100丸分别溶于125ml蒸馏水中制成混悬液，高剂量生药0.6 g/ml，低剂量生药0.3 g/ml，置4℃冰箱中备用。孕马血清(PMSG)，上海市计划生育科学研究所产品(批号20120410);人绒毛膜促性腺激素(HCG)，丽珠集团丽珠制药厂生产(批号120413)。

1.3 主要试剂及仪器

兔抗小鼠BMP-6(批号bs-3671R);BMPR II(批号bs-4237R);ALK-6(批号sc-25455);Smad1(批号bs-1619R);Smad5(批号bs-2973R);Smad8(批号bs-4253R);Smad4(批号bs-0585R)，以上抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司;ALK-2购自Abnova公司(批号PAB3474);RNA提取试剂盒购自美国ABI公司(批号AM1560);M-MLV反转录试剂盒购自美国Promega公司(批号M1701);SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒购自加拿大Fementas公司(批号K0221)。ND2000型紫外分光光度计，美国Thermo公司;ABI 7300型荧光定量PCR System，美国ABI公司。

2 方法

2.1 模型制备［7］

第11天同时腹腔注射PMSG 10IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10IU/只。正常组每日阴道涂片，观察动情周期。

2.2 动物分组及给药情况

将200只雌性小鼠按随机数字表法完全随机化分为4组，即疏肝高、低剂量组及控制性超排卵(COH)组和空白对照组各50只。于模型制备前10 d开始每日8∶00灌胃给药。疏肝高、低剂量组分别给予逍遥丸混悬液0.6 g/ml、0.3 g/ml，COH组和空白对照组用蒸馏水灌胃。各组小鼠均1 ml/100 g体质量灌胃，连续10 d。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 卵母细胞提取方法 空白对照组小鼠于阴道涂片见到大量角化上皮细胞的次日、其余各组小鼠于注射HCG 16 h后脱颈椎处死，在超净工作台上手术打开实验小鼠腹腔，分别取出双侧输卵管，置于装有PBS的培养皿中，在体视镜下用1 ml注射器针头针划破输卵管壶腹部，观察到有絮状物释出，此即为卵丘卵母细胞复合体(COCs)，然后用透明质酸酶消化掉颗粒细胞，用PBS反复冲洗，获得MⅡ期卵母细胞。

2.3.2 免疫组化染色 将35只小鼠所获取的MⅡ期卵母细胞移到多聚赖氨酸玻片表面，风干后用4%多聚甲醛固定120 min，30%过氧化氢混合纯甲醇浸泡30 min，5%牛血清白蛋白20 min。加入1 ∶50稀释的抗体2 h，按照SABC免疫组化方法分别加入兔抗山羊二抗、SABC各20 min。按照DAB显色法显色10 min，脱水后封片。结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱2方面采用IHS评分。评分方法为［8］:①阳性细胞数百分比(记为a):＜1%=0分，1%～10%=1分，11%～50%=2分，51%～80%=3分，81%～100%=4分;②阳性细胞显色强度(记为b):0分(阴性)、1分(弱阳性)、2分(阳性)、3分(强阳性);③a与b乘积为IHS评分进行半定量分析:0为(－)，1～4分为(+)，5～8分为(++)，9～12分为(+++)。

2.3.3 Real-Time RT-PCR检测BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8 和Smad4mRNA表达 将15只小鼠所分离的卵母细胞置于低温离心机中，4℃3000 rpm离心10 min，弃上清液，加入300 μL Lysis/Binding Solution裂解细胞，然后加入30 μL miRNA Homogenate Additive，吹打混匀，冰浴 10 min，加入 300 μL Acid-Phenol: Chloroform，漩涡混合30～60 sec，10000 rpm，室温离心5 min，吸取上清液转入新的离心管中，加入100%乙醇375 μL颠倒混匀。将上述液体加入离心柱内芯，10000 rpm离心约15 s，使液体滤过离心柱。弃掉下层滤过的液体，向离心柱芯中加入700 μL miRNA Wash Solution 1，10000 rpm离心约15 s，使液体滤过离心柱，弃掉下层滤过的液体，向离心柱芯中加入500 μL Wash Solution 2/3，10000 rpm离心约15 s，使液体滤过离心柱，弃掉下层滤过的液体，此步骤重复1次。离心柱10000 rpm离心2 min，将滤芯转入新的收集管中，向柱芯中央加入100 μL的Elution Solution，室温静置3 min，然后10000 rpm离心3 min，收集RNA溶解液，紫外分光光度计测定RNA的纯度。反转录于 PCR仪上42℃进行50 min，95℃加热5 min，灭火反转录酶，然后进行40个循环反应:94℃ 30 s，58℃30 s，72℃30 s，于每个循环的第三个步骤收集荧光信号，扩增完毕进入结果分析界面，根据CT数据方法，得到的目的基因表达的相对定量值(RQ值)，用于统计分析各指标mRNA的表达量。

2.4 统计学方法

应用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，若满足正态性及方差齐性，多组之间比较用方差分析，否则用秩和检验，计数资料采用χ2检验。

3 结果

3.1 各组小鼠卵母细胞 BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表达比较

免疫组化结果显示，空白对照组与COH组表现为胞质呈黄色，疏肝低剂量组表现为胞质呈黄色，边缘较深，呈棕黄色;疏肝高剂量组卵母细胞表现为胞质呈棕黄色。

表1显示，与空白对照组比较，COH组BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表达IHS评分差异无统计学意义(P＞0.05)，各治疗组 BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表达IHS评分均显著高于空白对照组及COH组(P＜0.05)，其中，疏肝高剂量组蛋白表达评分较疏肝低剂量组升高(P＜0.05)，疏肝高剂量组BMPR II蛋白表达增加(P＜0.05)。

表1 各组小鼠卵母细胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表达比较(±s)

表1 各组小鼠卵母细胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表达比较(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.05;与COH组比较:△P＜0.05;与疏肝低剂量组比较:□P＜0.05;与疏肝高剂量组比较:▽P＜0.05

指标/组别 空白对照组 COH组 疏肝低剂量组 疏肝高剂量组BMP-6蛋白 0.67±0.58 1.00±1.00□▽3.67±0.58＊△▽6.67±1.15＊△□BMPR II蛋白 2.00±1.00 1.67±0.58 2.33±0.58▽6.67±1.15＊△□ALK-2蛋白 0.67±0.58 1.33±0.58□▽3.00±1.00＊△▽6.67±1.15＊△□ALK-6蛋白 0.33±0.58 0.67±0.58□▽2.67±0.58＊△▽4.67±1.15＊△□Smad 1蛋白 0.67±0.58 0.67±1.15□▽2.67±0.58＊△▽4.67±1.15＊△□Smad 5蛋白 1.00±1.00 0.33±0.58□▽3.00±1.00＊△▽8.67±0.58＊△□Smad 8蛋白 0.67±0.58 1.00±1.00□▽2.67±0.58＊△▽8.67±0.58＊△□Smad 4蛋白 1.00±1.00 1.67±0.58□▽4.33±1.53＊△▽8.67±0.58＊△□

3.2 各组小鼠卵母细胞 BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和 Smad4 mRNA的表达比较

表2显示，与空白对照组比较，COH组BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)，疏肝高剂量组 BMPR II mRNA表达增加(P＜0.05);各治疗组 BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表达较空白对照组及COH组增加(P＜0.05);疏肝高剂量组表达高于疏肝低剂量组(P＜0.05)。

表2 各组小鼠卵母细胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表达比较(±s)

表2 各组小鼠卵母细胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表达比较(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.05;与COH组比较:△P＜0.05;与疏肝低剂量组比较:□P＜0.05;与疏肝高剂量组比较:▽P＜0.05

指标/分组 空白对照组 COH组 疏肝低剂量组 疏肝高剂量组BMP-6 mRNA 1.125±0.333 1.058±0.176□▽2.090±0.172＊△▽2.544±0.245＊△□BMPRIImRNA 0.922±0.138 0.981±0.085 0.870±0.146▽1.309±0.203﹡△□ALK-2 mRNA 0.884±0.095 0.944±0.049□▽2.107±0.225＊△▽2.577±0.189＊△□ALK-6 mRNA 0.942±0.041 1.015±0.036□▽3.165±0.061＊△▽3.448±0.175＊△□Smad 1 mRNA 1.063±0.055 1.084±0.073□▽2.393±0.160＊△▽2.734±0.270＊△□Smad 5 mRNA 1.116±0.127 1.048±0.115□▽2.120±0.162＊△▽3.329±0.161＊△□Smad 8 mRNA 1.159±0.139 1.088±0.134□▽1.512±0.137＊△▽3.780±0.167＊△□Smad 4 mRNA 1.045±0.053 1.063±0.094□▽2.450±0.113＊△▽▲3.428±0.046＊△□

4 讨论

卵泡的发育是一个连续变化的动态过程，需要多种因素的调节，除了各种垂体释放的激素以外，卵泡发育还依赖于各种生长因子的作用，这其中TGF-β超家族起关键性的作用［9］。目前认为，TGFβ超家族的成员与Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，与Ⅰ型受体共同作用启动信号传导［1］。Ⅰ型受体主要有3种，分别为BMPR-IA、BMPR-IB及ActR-I(又称Alk-3、Alk-6及Alk-2)。Ⅱ型受体主要有3种，分别为BMPR-Ⅱ、ActR-ⅡA及ActR-ⅡB。Smads是TGF-β超家族下游信号传导分子，可将胞外信号从细胞膜传递入细胞核，在TGF-β信号传导过程中发挥重要作用。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是属于TGF-β超家族的多肽蛋白，其主要功能是诱导骨的发育和形成，并调节哺乳动物生长、细胞分化与凋亡等。BMP-6是骨形态发生蛋白家族成员之一，其基因定位在小鼠的13号染色体上，定位在人的6p24-6p23［10］。在卵泡发育过程中，卵母细胞和颗粒细胞是BMP-6的主要来源［11-15］，目前对BMP-6信号途径的研究还不深入，ALK-2、ALK-3、ALK-6已被鉴定为BMP-6的潜在Ⅰ型受体，其中ALK-2、ALK-6与 BMP-6亲和力最强，BMPRⅡ、ActR-ⅡA和ActR-ⅡB被鉴定为潜在的Ⅱ型受体，但尚未确定不同类型卵巢细胞中BMP-6受体的差异［16］。在信号传导过程中，Ⅱ型受体首先与配体结合形成受体复合物，然后募集Ⅰ型受体使其发生磷酸化而活化，活化的BMPⅠ型受体进而磷酸化细胞内信号受体Smad1、Smad5和Smad8，然后与Smad4形成聚合体，转入细胞核内直接作用于下游靶基因，或与其他转录调节因子一起作用于靶基因［17］。

中医认为，肝主藏血，女性正常生理功能的经、孕、胎、产都以血为用，故叶天士在《临证指南医案》中提出“女子以肝为先天”。肝主疏泄，喜条达，情志失调可导致肝的疏泄功能失常，进而影响女性的生殖功能。《济阴纲目》记载:“情不宣畅，经多不调，故难成孕。”本课题组前期研究提示，逍遥丸有调节卵巢功能的作用，可使无排卵大鼠优势卵泡内见到卵母细胞［18］。逍遥丸是在宋·《太平惠民和剂局方》“逍遥散”的基础上应用现代生产工艺技术所制成的新型中药制剂，可疏肝解郁、养血调经。方中柴胡疏肝解郁、条达肝气;当归、白芍补气养血调经;白术、茯苓、甘草健脾益气，助脾化气以养肝阴，使营血生化有源，以增加当归和白芍的养血之功。诸药合用疏肝解郁、养血活血，佐以健脾使气血调和、冲任二脉调畅，卵细胞正常发育及排出。

本研究结果显示，与空白对照组及COH组比较，各治疗组小鼠卵母细胞BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白及基因的表达增强，其中疏肝高剂量组的表达优于疏肝低剂量组，疏肝高剂量组BMPR II蛋白及mRNA表达增加，提示逍遥丸可能是通过调节小鼠卵母细胞BMP-6的表达，募集BMP-6Ⅱ型受体BMPRⅡ形成受体复合物，然后募集Ⅰ型受体ALK-2和ALK-6，使其发生磷酸化而活化，活化的Ⅰ型受体进一步磷酸化细胞内信号Smad1/5/8，然后与Smad4结合，从而启动信号传导。在这一过程中，疏肝高剂量组的作用明显优于低剂量组。本实验从信号通路的角度证实，疏肝法在干预卵泡发育和卵母细胞质量方面效果显著，进一步丰富了中医学“肝肾同源”、“精血互化”以及“肝主藏血”、“女子以肝为先天”的理论基础，也为在临床干预不孕症及作为IVF-ET的辅助治疗方案提供了坚实的实验基础。

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Effect of Xiaoyao Pill on the Expression of BMP-6/Smads Signal Pathway in Mouse Oocytes

YANG Li-yun，DU Hui-lan△，BAI Jing，SUN Xiao-huan，FAN Li-jie
(Hebei University of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050091，China)

Objective:To investigate the effects of Xiaoyao Pill on the expression of BMP-6，BMPR II，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in mouse oocytes．Methods:200 mice were randomly divided into 4 groups:Shugan high dose group，Shugan low dose group，COH group and control group(N=50)，the expression of BMP-6，BMPR II，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in mouse oocytes were detected by immunohistochemistry and Real-time PCR．Results:Compared with the control group，the protein content and mRNA expression of BMP-6，BMPRII，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in the COH group have no statistical significance．the protein content and mRNA expression of BMP-6，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in the treatment groups increased．The protein and mRNA expression in Shugan high dose group were higher than the Shugan low group．The protein and mRNA expression of BMPR II in Shugan high dose group were increased．Conclusion:Xiaoyao Pill can improve the expression of BMP-6 in mouse oocytes，activate its second type of receptor BMPRⅡ，and then activate receptors ALK-2/6，the acitvation of type 1 receptors phosporylate intracellular signal Smad1/5/8，then combine with Smad4，and start the signal transduction of Smads pathway to intervene the development and quality of oocytes．．

Xiaoyao Pill;Oocyte;BMPRII;ALK-2;ALK-6;Smad1;Smad5;Smad8;Smad4

R285．5

B

1006-3250(2015)03-0294-04

2014-12-02

国家自然科学基金面上项目(81173294)

杨丽芸(1979-)，女，河北香河人，讲师，医学博士，从事中医药防治生殖内分泌的基础与临床研究。

△通讯作者:杜惠兰(1950-)，女，河北石家庄人，教授，医学博士，从事中医药防治生殖内分泌的基础与临床研究，Tel: 13931150880，E-mail:duhuilan@163．com。