川芎嗪对乏氧人肺癌细胞β1-整合素及钙依赖黏附素表达的影响*

任为民，张培彤，张明辉

(1．河南省中医药研究院，郑州 450004;2．中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

川芎嗪对乏氧人肺癌细胞β1-整合素及钙依赖黏附素表达的影响*

任为民1，2，张培彤2△，张明辉2

(1．河南省中医药研究院，郑州 450004;2．中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

目的:探讨川芎嗪对乏氧人巨细胞肺癌(PG)细胞表达β1-整合素和钙依赖黏附素的影响。方法:PG细胞复苏，分为川芎嗪高、中、低剂量组及顺铂组、阴性对照组，置常氧和低氧环境培养，检测E-cadherin(CD324)、β1-整合素(CD29)的表达。结果: PG细胞CD324常氧组表达大于低氧组;在常氧和低氧环境中，各实验组CD324表达均大于对照组;常氧组CD29表达低于低氧组。结论:在乏氧环境下PG细胞有更高的转移能力，川芎嗪能够抑制PG细胞的转移能力。

人巨细胞肺癌细胞;川芎嗪;β1-整合素;钙依赖黏附素

细胞间黏附分子表达的异常与肿瘤转移密切相关。整合素β-catenin表达的上调有利于肿瘤细胞的侵袭和转移［1］。钙相关黏附素E-cadherin失活变异则促进肿瘤转移［2］。组织微环境缺氧通过上调β-catenin、下调E-cadherin增强肿瘤细胞的转移能力［3］。本实验利用川芎嗪(TMP)干预常氧、低氧微环境下生长的人高转移性巨细胞肺癌(PG)细胞，通过流式细胞术检测 PG细胞表面 E-cadherin (CD324)及β1-整合素(CD29)表达的变化来研究川芎嗪对PG细胞转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株

PG细胞由中国中医科学院广安门医院肿瘤实验室提供。

1.2 主要药物、试剂及仪器

RPMI 1640培养基:GIBCO;胎牛血清(FBS):中国杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶(Trypsin):Amresco产品;盐酸川芎嗪:中国药品生物制品检定所提供，批号 110817-200305;顺铂(DDP):云南个旧生物药业有限公司，批号090911; PE anti-human CD324(E-Cadherin):美国Biolegend; PE Mouse IgG1，κIsotype Ctrl(FC):美国Biolegend; PE MouseAnti-Human CD29:美国 BD;PE Mouse IgG2a，κIsotype Control:美国Milipore。CO2细胞培养培养箱:日本Sanyo公司;低氧工作站INVIVO2200:英国RUSKINN公司;超净工作台:北京长城空气净化工程公司;电子天平:Saitorius BS400S，北京赛多利斯天平有限公司;可调式微量加样器:德国Eppendorff公司;TE200-U荧光倒置显微镜:日本Nikon。

1．3 方法

1．3．1 细胞培养 常规复苏PG细胞，用含有10%FBS、10万u/L青霉素、10万u/L链霉素的RPMI1640培养液，分别置于常氧环境(CO2培养箱: 5%CO2、95%空气)、低氧环境(低氧工作站:5% O2、5%CO2、90%N2)传代培养。

1．3．2 流式细胞仪检测PG细胞CD324、CD29表达 取常氧和乏氧培养对数生长期的PG细胞，胰酶消化，以1×105/ml的密度悬浮于RPMI 1640培养基，待细胞贴壁后分别加入以 10%FBSRPMI1640培养液配制的盐酸川芎嗪(TMP)，使其终浓度分别为 240 μg/ml(TMPH)、120 μg/ml (TMPM)、10 μ g/ml(TMPL)。同时设阴性对照组(Control，只加细胞和培养液)、顺铂组(DDP，2 μg/ ml)作为阳性对照，分别置常氧和低氧培养48 h，各组PG细胞用胰酶消化，以PBS液(pH 7.4)吹打收集细胞，再以PBS洗2遍，复悬于PBS溶液中(1× 106cells/100 μL)。加入流式上样管，每管100 μL，每组分设实验管和同型对照管，实验管分别加入CD29 PE(20 μL)、CD324 PE(20 μL)，同型对照分别加入PE Mouse IgG2a、κ Isotype Control(20 μL)、PE Mouse IgG1、κ Isotype Ctrl(20 μL)，37℃避光孵育30 min，PBS洗2遍，过200目尼龙筛网，每个实验重复3次，每个样品收集104个细胞。测定采用美国BD公司出品的FACS Calibur分析型流式细胞仪。机器测试条件为FSC电压E-1，增益6.14，线性;SSC电压320mv，增益1.00，线性;FL1电压400 mv，对数;FL2电压340 mv，对数;激光功率15 mv，激发光波长488 nm。校正机器后，先以前向角和侧向角散射光形成的细胞散点图设定收集门，以固定条件收集样本。每个样品管收集104个肿瘤细胞后进行分析，采用Macintosh Quadra 650计算机和Cell Quest软件收集处理样品数据，各组数据进行统计分析并得出结论。

1．3．3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，多个样本均数比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测常氧和低氧培养PG细胞CD324表达情况

表1图1显示，在常氧和低氧环境中，各试验组PG细胞 CD324表达阳性率均大于对照组(P＜0.05)。

表1 PG细胞CD324的表达(±s)

表1 PG细胞CD324的表达(±s)

注:与control比较:aP＜0.05，aaP＜0.01

药物 药物浓度(μg/ml)常氧荧光强度TMP 240 57.80±13.86aa11.52±2.74 32.82±15.49aa低氧表达阳性率(%) 荧光强度 表达阳性率(%) 16.58±6.96 TMP 120 49.66±16.55aa11.42±1.01 40.60±21.56aa14.74±6.19 TMP 10 41.70±19.02a11.62±2.16 25.11±14.39a14.39±7.10 DDP 2 44.31±14.81aa16.70±5.06 34.44±17.56aa20.00±7.28 Control — 20.79±11.05 11.52±2.74 9.16±8.16 16.01±9.13

图1 PG细胞CD324表达情况(N常氧，H低氧)

2.2 流式细胞术检测常氧和低氧培养PG细胞CD29表达

表2图2显示，PG细胞CD29在常氧和低氧微环境中各组的表达阳性率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。但常氧对照组CD29表达的平均荧光强度低于低氧对照组(P＜0.01)。

3 讨论

β1整合素介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附反应与肺癌转移关系密切［4］。钙相关黏附素(CD324)表达缺失，与人类肺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌的转移密切相关［5］。肺癌患者存在血瘀证，晚期病人更为明显［6］。血瘀证存在微循环障碍和组织缺氧的病理改变［7］，而组织微环境缺氧可通过调控癌细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因，进而影响细胞E-cadherin和 β1-catenin分布，并促进癌细胞的迁移、浸润和与血管内皮细胞的黏附［8］。本研究结果显示，细胞乏氧导致PG细胞CD324表达阳性率下调，同时CD29表达上调。据此我们推断，在乏氧环境下PG细胞有更高的转移能力，这与临床上晚期肺癌病人血瘀证增加的观察结果相符。

表2 PG细胞CD29的表达(±s)

表2 PG细胞CD29的表达(±s)

注:与常氧时比较:bbP＜0.01

药物 药物浓度(μg/ml)低氧表达阳性率(%) 荧光强度 表达阳性率(%)常氧荧光强度TMP 240 99.28±0.32 78.47±22.81 99.34±0.55 134.30±32.61 TMP 120 99.58±0.28 82.82±18.04 98.44±1.25 118.75±40.62 TMP 10 99.35±0.45 64.22±28.66 99.04±0.67 127.79±30.50 DDP 2 98.95±0.66 80.98±36.03 98.24±1.34 129.10±26.10 Control — 99.25±0.46 73.22±23.78 99.13±0.71 101.15±39.53bb

图2 PG细胞CD29表达情况(N常氧，H低氧)

川芎嗪是活血药川芎的主要成分。韩子敏等研究证明，黄芪、川芎嗪能够抑制肾癌转移［9］。陈少贤等发现，川芎嗪能够减轻肺癌患者高凝状态，达到抗肿瘤转移的作用［10］。试验证明，TMP能抑制小鼠Lewis肺癌的生长与转移［11］，还可明显抑制人肺巨细胞癌细胞(PG)与内皮细胞的黏附［12］以及对Boyden小室的侵袭［13］。本实验结果显示，在常氧和低氧环境中，川芎嗪能上调 PG细胞 E-cadherin (CD324)的表达，表明川芎嗪能够通过调控肿瘤转移相关黏附分子抑制肺癌的转移。

［1］ 张林，孟龙，王磊，等．非小细胞肺癌中VEGF、CD44v6的表达及其与肺癌侵袭、转移及预后关系的研究［J］．中国肺癌杂志，2004，7(5):427-430．

［2］ Wu W，Walker AM．Human chorionic gonadotrop in beta(HCG-beta)down-regulates E-cadherin and promotes human prostate carcinoma cell migration and invasion［J］．Cancer，2006，106 (1):68-78．

［3］ 董兰兰，袁响林，于世英，等．shRNA干扰HIF-1α对人宫颈癌细胞黏附分子表达的影响［J］．中国肿瘤生物治疗杂志，2008，15(1):46-50．

［4］ Vander Filer A，Sonnenberg A．Function and interaction of integrins［J］．Cell Tissue Res，2001，305(3):285-290．

［5］ 刘卫国，文明星，吕新生．上皮钙黏附素系统在肿瘤中的意义及其调控［J］．国外医学·生理病理科学与临床分册，1999，16(3):241．

［6］ 李道睿，张培彤，胡晓梅，等．300例中晚期原发性支气管肺癌血瘀证分布规律的调查研究［J］．中国中医药信息杂志，2007，14(3):19-20．

［7］ 魏海峰，亚白柳，赵玲，等．急性脑缺血大鼠模型血瘀证舌象表现的评价方法及其与血液流变学的关系［J］．中西医结合学报，2008，6(1):73-76．

［8］ 沈维干．低氧对人肺腺癌A549细胞迁移和黏附的影响［J］．肿瘤，2008，28(3):216-219．

［9］ 韩子敏，王巧凤，高福音，等．黄芪与川芎嗪注射液加免疫化学治疗转移性肾癌的临床观察［J］．中国中西医结合肾病杂志，2005，6(8):481-482．

［10］ 陈少贤，王良兴，邢玲玲，等．川芎嗪对晚期肺癌患者血小板功能的影响［J］．中国中西医结合杂志，1997，17(9):531-533．

［11］ 徐晓玉，严鹏科，陈刚，等．川芎嗪对小鼠肺癌血管生长和VEGF表达的抑制［J］．中国药理学通报，2004，20(2):151-154．

［12］ 林洪生，李树奇，裴迎霞，等．川芎嗪苦参碱对癌细胞与内皮细胞黏附及黏附因子表达的影响［J］．中国新药杂志，1999，8 (6):384-386．

［13］ 张培彤，裴迎霞，祁鑫，等．活血药对人肺癌细胞黏附和侵袭的影响［J］．中国中西医结合杂志，1999，19(2):103-105．

Effect of Tetramethylpyrazine on Expression of β1-integrin and E-cadherin on the Surface of Cell PG in Hypoxic Environment

REN Wei-min1，2ZHANG Pei-tong2△，ZHANG Ming-hui2
(1．Henan Province Chinese medicine research institute，Zhengzhou，Henan 450004，China; 2．Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Objective:To investigate the effect of Tetramethylpyrazine(TMP)on the expression of β1-integrin(CD29) and E-cadherin(CD324)on the surface of cell PG cultured during normoxia and hypoxia．Methods:The revival cell PG was divided into three dosages(high，medium and low)group of Tetramethylpyrazine，DDP group and negative control group．All of five groups were cultured separately in the normal and hypoxic environment．The expression of CD324 and CD29 on the surface of PG cell were detected by the flow cytometry 48 h later．Results:The positive rate of PG cells’CD324 expression of normal oxygen group is higher than hypoxic group(P＜0.01)．In normoxic and hypoxic microenvironment，the expression rate of all experimental group is higher than control group(P＜0.05)．The intensity of PG cells’CD324 expression of normal oxygen group is lower than hypoxic group(P＜0.01)．Conclusion:PG cells have a higher metastatic ability in the hypoxic microenvironment．In the normoxic and hypoxic microenvironment，tetramethylpyrazine can inhibit metastasis ability of PG cells through regulating the metastasis-associated adhesion molecules．

PG cell;Tetramethylpyrazine;β1-integrin;E-cadherin

R734．2

B

1006-3250(2015)03-0291-03

2014-12-24

国家自然科学基金面上项目(30873334)

任为民(1972-)，男，河南郑州人，主治医师，医学硕士，从事中西医结合肿瘤学的临床与研究。

△通讯作者:张培彤，男，安徽人，主任医师，医学博士，博士研究生导师，从事中西医结合肿瘤学研究，E-mail: zhangpeitong@sohu．com。