山羊传染性胸膜肺炎的实验室诊断

莫昌院，覃 岚，孟 姣，李玉武，杨雪贞，程振涛

(贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是山羊的高度接触性传染病，被国际兽疫局列为B类动物疫病，临床上以高热、卡他性鼻液、咳嗽、眼结膜炎、呼吸道啰音、纤维素性胸膜炎以及部分母羊流产、进行性消瘦为主要特点［1］。国内外研究结果表明，引起山羊传染性胸膜肺炎的支原体有多种，我国羊传染性胸膜肺炎病原主要为丝状支原体山羊亚种(Mmc)和绵羊肺炎支原体(Mo)［2］，其中较早资料多认为病原为 Mmc，但近年来全国各地不断报道Mo引起的CCPP病例，且呈逐年上升趋势。1999年，贵州省也曾报道CCPP病例的发生，且病原为 Mmc［3］。2010年，贵州省首次报道发病山羊组织中分离到Mo菌株［4］。因临床上2种病原感染所致症状很难区分，最终诊断尚需实验室检测。

1 材料与方法

1.1 病料与菌株 临床病例材料采自贵州省开阳县某养殖场;丝状支原体山羊亚种标准株(PG3)、绵羊肺炎支原体标准株Y98均由贵州大学预防兽医学实验室提供。

1.2 试剂 DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂购自宝生物(大连)科技有限公司;支原体肉汤培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.3 病原分离培养与初步鉴定

1.3.1 培养基制备:(1)液体培养基:取支原体肉汤培养基2.752 g，蒸馏水80 mL加热溶解，调pH值至7.4 ～7.6，分装试管(4 mL/支)，121 ℃高温高压灭菌30 min后，每支试管加入马血清(终浓度200 mL/L)、10%醋酸铊(终浓度20 mL/L)、青霉素(终浓度200 IU/mL)。(2)固体培养基:取支原体肉汤培养基2.752 g、琼脂粉1 g、蒸馏水80 mL加热溶解，调 pH 值至7.4～7.6，121℃高温高压灭菌30 min后，待冷却至70℃左右加入马血清(终浓度200 mL/L)、10%醋酸铊(终浓度20 mL/L)、青霉素(终浓度200 IU/mL)，混匀，无菌分装平皿。以上培养基4℃保存备用。

1.3.2 病原分离培养:无菌采集病羊肺组织，用剪刀剪碎后放入液体培养基内，37℃、5%CO2环境中培养 3～7 d，待培养基颜色变化后，用0.45 μm微孔滤器过滤，进行传代培养，同时接种固体培养基，每隔2～3 d观察1次，待出现单个菌落，挑取接种于液体培养基培养。如此连续传代纯化3次以上。

1.3.3 形态学鉴定:将纯化的菌株接种固体培养基，37℃培养3～7 d观察生长状况，至出现针尖大小透明菌落，置低倍显微镜下观察菌落形态，并拍照记录。

1.3.4 生化鉴定:按照OIE提供的生化试验方法，对分离纯化的菌株进行细菌L型还原试验合格后，作发酵葡萄糖、水解精氨酸、分解尿素、分解甘露醇、四氮唑还原试验，同时以Mmc标准株PG3、绵羊肺炎支原体标准株Y98作对照。

1.4 病原核酸PCR检测

1.4.1 引物设计与合成:参照GenBank Mo标准菌株16S rRNA基因序列(登录号:NR-025989)，设计合成特异性引物Mo1/Mo2(见表1)，送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 Mo 16S rRNA基因引物序列

1.4.2 病原核酸检测:取支原体液体培养物应用DNA提取试剂盒提取所需DNA样本。以引物Mo1/Mo2对所提DNA进行PCR扩增，建立50.0 μL体系:10 ×buffer(含 Mg2+)5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，引物Mo1/Mo4(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板3 μL，灭菌ddH2O补足。扩增条件为:94℃预变性3 min;94 ℃变性45 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，共34个循环。最后72℃延伸10 min。在凝胶成像仪上观察结果。

图1 菌落形态

2.2 生化试验鉴定结果 见表2。

表2 生化鉴定结果

由表2可见，本试验支原体分离株生化试验结果与绵羊肺炎支原体标准株Y98完全相同，而与Mmc标准株存在差异。

2.3 PCR鉴定结果 初步确定分离株为Mo后，为进一步确定支原体分离株分类地位，用PCR方法对支原体分离培养物进行鉴定，以标准菌株16S rRNA基因特异性引物对分离株及标准菌株进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。由图2可见，支原体分离株可扩增出与Mo标准株大小一致的1 149 bp目的条带，进一步确定所分离支原体确为Mo。

2 结果

2.1 病原分离与形态观察 液体培养基颜色由红色变为黄色;经固体培养基培养5 d后，低倍镜观察，可见分离菌株菌落不呈典型的支原体“油煎蛋”状，而呈圆形凸起，无中心脐。见图1。

图2 支原体分离株PCR鉴定

3 结论与讨论

3.1 我国自20世纪40年代在甘肃有本病报道后，内蒙古、四川、河北、云南、江西等地相继有临床病例报道［5，6］。王栋等［7］对中国兽医药品监察所保存的CCPP病原进行了鉴定，结果发现这些病原在形态特征、培养特性、生化特性和血清学反应方面均与丝状支原体山羊亚种(Mmc)国际模式株PG3一致，因而认为引起我国CCPP的病原应该是Mmc。而后国内研究者先后从甘肃、辽宁等地分离到致病性绵羊肺炎支原体(Mo)［8］。统计数据显示，Mmc和Mo为山羊传染性胸膜肺炎的主要病原。在贵州，万一元等［9］2001年于罗甸等地分离到 Mmc，2011 年张双翔等［4］首次分离到Mo。本试验结果显示，绵羊肺炎支原体感染病例在我省山羊病例中持续存在，且存在区域扩大趋势。

3.2 目前，我国对CCPP病原鉴定工作多基于分离培养技术及生化试验，但存在诸多困难，一是支原体个体微小，生物合成代谢能力有限，营养要求高，人工培养增殖难度较大，致使其分离培养也十分困难;二是仅通过传统的形态学、生化鉴定等方法难以准确确定支原体分类地位。随着分子生物学技术的出现与发展，现代分子生物学成为鉴定支原体的有效手段［10］。本试验通过形态学观察、生化试验特性等传统方法对分离菌株进行初步鉴定，结果显示，分离株与绵羊肺炎支原体模式株Y98相符，与丝状支原体山羊亚种模式株PG3存在差异，初步判定分离株为Mo，命名为 Mo-GZ-03。研究资料表明，16S rRNA基因序列分析是鉴定支原体种属的一个可靠方法［11］。综合分离株的菌落形态、生化试验特点以及PCR检测结果，可证明本次疫情病原分离株为绵羊肺炎支原体，为疫情的有效控制提供了理论依据。

［1］ Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals，4th edition，2004.

［2］ 邓光明.类山羊传染性胸膜肺炎诊断和防治的研究［J］.中国兽医科技，1991，21(6):6 ～9.

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［4］ 张双翔，周碧君，姜汉雯，等.山羊传染性胸膜肺炎继发大肠埃希氏菌感染的诊断［J］.贵州农业科学，2011，39(6):144 ～146.

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［11］ 郭晗，褚岳峰，赵萍，等.山羊支原体山羊肺炎亚种甘肃株的分离及鉴定［J］.中国兽医学报，2011，31(3):352～356.