武汉市售茶中2种食源性致病菌的检测与分析

窦玉淼，张 飞，张 翼，陈雅蘅，周帼萍

(武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北 武汉 430023)

武汉市售茶中2种食源性致病菌的检测与分析

窦玉淼，张 飞，张 翼，陈雅蘅，周帼萍*

(武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北 武汉 430023)

为了解市售茶叶中菌落总数和2 种食源性致病菌（蜡样芽孢杆菌和克罗诺杆菌）的检出情况，根据国标对武汉地区市售的46 份茶叶样品进行菌落总数和2 种食源性致病菌的初步分离和鉴定，分别用16S rDNA内转录间隔区-聚合酶链式反应方法鉴别蜡样芽孢杆菌，用16S rDNA和fusA序列分析对疑似克罗诺杆菌的分离株进行鉴定，进而比较和分析不同产地和类别间微生物的检出情况。结果发现，蜡样芽孢杆菌在市售茶叶中检出率极高，达97.9%，而且其数量约占细菌总数的6.0%。鉴定出3 株阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter），其检出率达6.5%，仅占细菌总数的0.1%～3.2%。花草茶中细菌总数最高，也是唯一检出克罗诺杆菌的茶类；发酵茶中蜡样芽孢杆菌数量最高，均超过1 100 MPN/g。不同产地茶叶在这3 个微生物指标上有显著差异。当茶及其深加工产品和其他食品原辅料混搭成新产品时，这2 种食源性致病菌可能带来风险隐患。

茶；细菌总数；蜡样芽孢杆菌；克罗诺杆菌；检测；鉴定

随着茶叶深加工技术的发展，茶不仅作为传统饮品，也以各种形式（浸提物、膏、粉、汤等）添加到多种食品中，特别是各种抹茶糕点、冰激凌等在市场上广受欢迎；同时向茶汤中添加多种配料，成为奶茶、珍珠奶茶等成为风尚。传统的饮用方法，因茶叶水分活度低、冲泡温度高、冲泡后一般立即饮用，不含糖类或蛋白质类营养物（或含量极为低微），一般不存在微生物方面的食品安全隐患。但是一旦混搭其他食品，特别是糕点、奶制品就可能带入微生物隐患。

因水分活度低，茶叶及其深加工产品中芽孢杆菌、耐干燥的细菌和霉菌为其中优势菌群[1]。以往的研究比较重视茶叶中真菌、毒素的检测以及肠杆菌超标等有害微生物污染[2-3]。但是研究发现茶叶中有2 种食源性致病菌:蜡样芽孢杆菌和克罗诺杆菌（原阪崎肠杆菌）检出率较高，而且部分样品中含菌量很高[4]。这2 种条件致病菌在传统饮茶习惯中危害很小，但是一旦和淀粉、乳制品混搭，这两者就可能导致很高的安全风险。为此，特收集市售茶以调查菌落总数及这两种食源性致病菌的情况。

蜡样芽孢杆菌的鉴定目前有很大争议。蜡样芽孢杆菌群细菌（B. cereus group）原来包括了蜡样芽孢杆菌（B. cereus）、炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）、蕈状芽孢杆菌（B. mycoides）和假蕈状芽孢杆菌（B. pseudomycoides）、韦氏芽孢杆菌（B. weihenstephanensis）6 个种，2013又增加了B. cytotoxicus[5]。由于该群内各种间在基因组上的高度一致，必须采用非常复杂的生理生化反应结合分子生物学技术才能鉴定，加上一些新种的定义还存在很大争议，要准确鉴定蜡样芽孢杆菌几乎成为非常复杂任务；现行的国家标准和美国食品药品监督管理局标准都未与最新分类系统接轨，同时很多研究者也质疑标准中所采用生理生化法的繁琐和准确性[6]；同时因为蜡样芽孢杆菌的很多毒素基因，除呕吐毒素合成相关基因外，都位于基因组内，并广泛分布在蜡样芽孢杆菌群各种菌株中，所以很多学者在探讨食品安全问题时也将蜡样芽孢杆菌群细菌一起讨论[7-8]。本研究鉴定的蜡样芽孢杆菌，严格意义上仅鉴定到蜡样芽孢杆菌群，排除了苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和假蕈状芽孢杆菌，但是未区分其他4 个种。

Iversen等[9-10]根据表型和基因型特征将阪崎肠杆菌成立一个新属-克罗诺属Cronobacter，并分为6 个种，2013年7月又改为10 个种[11-12]。阪崎肠杆菌的常规鉴定和分类主要依据生理生化性质，但已发现生化分型与分子分型结果有偏差，已不再适用于鉴别该属下种的划分。我国国标与国际最新分类体系出现了偏离，这不仅是分类学的问题，也涉及到安全性评价。因为目前发现只有阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii），C. turicensis和C. malonaticus对人类有感染力，尤其值得重视的是C. sakazakii与婴幼儿脑膜炎密切相关[13-14]。克罗诺杆菌对婴幼儿危害很大，所以对婴幼儿食品中克罗诺杆菌的监控和检测很多，但是国内尚未重视其他食品原辅料中克罗诺杆菌的检出情况，而国外研究发现该类细菌实际上在食品和环境中广泛存在。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基及试剂

于2013年9—12月购自湖北省武汉市大型茶叶批发市场。共采集46 个样，包括不发酵茶、半发酵茶、发酵茶及花草茶。

培养基:平板计数琼脂（plate count agar，PCA）、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤、甘露醇卵黄多黏菌素琼脂（mannitol-egg-yolk- polymyxin agar，MYP）、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium，mLST-Vm）。

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂（2×Taq PCR MasterMix） 北京Aidlab公司；PCR反应产物由苏州金唯智公司进行测序，对测序结果进行编辑和修正后提交给GenBank数据库。

1.2 仪器与设备

T-Gradient Thermoblock PCR仪 德国Biometra公司；DYY8B型稳压电泳仪 北京市六一仪器厂；GBOX-H12-E-M自动凝胶图像分析系统 英国Syn-gene公司；80i正置荧光相差显微镜（YS100） 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 样品中微 生物的检测与计数

克罗诺杆菌的检测:参照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验:阪崎肠杆菌检验》[15]；蜡样芽孢杆菌的测定:参考GB/T 4789.14—2003《食品卫生微生物学检验:蜡样芽胞杆菌检验》[16]；菌落总数的测定:参考GB 4789.40—2010《食品微生物学检验:菌落总数测定》[17]。菌落总数采用梯度稀释用PCA培养基检测；蜡样芽孢杆菌和克罗诺杆菌采用MPN法。

1.3.2 克罗诺杆菌疑似菌株的16S rDNA及fusA序列分析

fusA序列分析（http://pubmlst.org/cronobacter/）数据库网站所列Cronobacter细菌的管家基因中的fusA进行PCR扩增。PCR反应产物由苏州金唯智公司进行测序。对16S rDNA的测序结果进行编辑和修正后提交给GenBank和获得编号，并用Mega 6.0软件进行聚类分析；fusA序列提交MLST数据库，获得等位基因号，并用Splitstree4软件进行聚类分析。

1.3.3 蜡样芽孢杆菌群细菌的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)-PCR检测

16S-23S rDNA 间隔区引物:ITS-16S-1392-S-15（GNACACACCGCCCGT）；ITS-23S-206-A-21（NCTTAGATGTTTCAGTTCVCY）。PCR扩增体系: 2×Taq PCR Mix 25 μL；上下游引物各1 μL；DNA模板5 μL；加水至50 μL。扩增条件:95 ℃、1 min；95 ℃、45s；55 ℃、1 min；72 ℃、1 min 30 s；循环30 次；后延伸72 ℃、5 min[12-13]。

1.3.4 蜡样芽孢杆菌群细菌的形态观察

染色后用显微镜观察有无伴孢晶体排除苏云金芽孢杆菌；在PCA和溶菌肉汤平板上是否根状生长，排除蕈状和假蕈状芽孢杆菌；确定蜡样芽孢杆菌的管数，由最大或然数（most probable number，MPN）表计算蜡样芽孢杆菌的MPN值。

1.4 统计分析

采用SPSS 20.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 蜡样芽孢杆菌的鉴定

挑取在MYP培养基上具有典型蜡样芽孢杆菌落特征的分离株进行16S/23S rDNA ITS-PCR，如图1所示，在500、750 bp有2 条特征带，和标准株一致，视为蜡样芽孢杆菌。

2.2 克罗诺杆菌的鉴定

克罗诺杆菌在mLST-Vm培养基上具有典型菌落同时在TSA培养基上产黄色菌落者，视为疑似菌株，通过16S rDNA序列分析进行属的鉴定，进而用fusA序列分析对已经鉴定为克罗诺杆菌的菌株进行种的鉴定。

图2是Mega 6.0用邻近法构建的基于16S rDNA序列分析的系统进化树，图中Bootstrap为200，图下标尺表示每200 个碱基序列中有一个碱基替换，括号中为GenBank登录号。

从5 个花草茶样品中共分离到5 个疑似克罗诺杆菌的分离株，进行16S rDNA序列分析，发现来自16和20号样本中的2 个菌株可以鉴定为埃希氏菌属（Escherichia spp.），有3 个菌株CSWHPU-39、40、41（分别来自21、22、23样品）可鉴定为克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）。

16S rDNA序列分析被公认为微生物鉴定的金标准，但是其结果只能准确到属，种的鉴定还需要参考其他方法。截至2014年7月19日在Cronobacter MLST数据库中收集了自1950年以来全球超过36 个国家812 个菌株共293 个ST(sequence type)型的信息,是该属细菌最大、最全面的数据库。用Splitstree 4分析数据库中7 个管家基因的所有序列，发现fusA基因是进化最稳定的基因，但其序列多样性又可区分最新分类系统中克罗诺杆菌的10 个种及其进化关系，所以选用fusA基因序列分析做菌种鉴定。用数据库中所有100 个fusA等位基因做出进化树如图3所示。据此,CSWHPU-39为fusA_7,鉴定为丙二酸盐克罗诺杆菌C. malonaticus；CSWHPU-40为fusA_73,鉴定为C. pulveris；CSWHPU41为fusA_41,鉴定为都柏林克罗诺杆菌C. dublinensis。

2.3 市售茶叶中细菌总数和2 种食源性致病菌的检出情况

从表1可见,蜡样芽孢杆菌在46 份茶叶样品中检出率高达97.9%,仅有一个产自安徽的桂花茶样品中低于MPN检测下限(3 MPN/g),33 份样品(71.7%)含菌量都超出MPN检测上限(1 100 MPN/g),最高可超过细菌总数的33.4%,是茶叶样品中不可忽视的优势菌；而另一个食源性致病菌-阪崎肠杆菌则检出率仅为6.5%(3/46),只有3 份样品安徽出产的花草茶样品检出了阪崎肠杆菌,仅为细菌总数的0.1%～3.2%,并非优势菌群。

2.4 不同种类茶叶之间的比较

根据茶叶原料和加工工艺,可以大致把茶分为：花草茶、不发酵茶、半发酵茶和发酵茶4 种类别。为方便计算,将所有蜡样芽孢杆菌数量中大于1 100 MPN/g,都按照1 100 MPN/g来计算。比较这4 种不同种类茶叶中微生物的数量,发现花草茶的细菌总数明显高于其他品种,达到(23 264±11 919) CFU/g,蜡样芽孢杆菌数量仅次于发酵茶((898±414) MPN/g),花草茶也是4 种茶叶中唯一检出克罗诺杆菌的种类；发酵茶的蜡样芽孢杆菌数量显著高于其他品种,均大于1 100 MPN/g,而半发酵茶细菌总数和蜡样芽孢杆菌数量都低于其他品种,不发酵茶其次。详见图4、5。

2.5 不同产地之间的比较

因为我国茶叶产地甚多，武汉市售茶叶的采样过程中安徽（10）、湖北（12）和福建（11）样本数量相当，其他10 个省（地区）样本数量过低（≤2），所以仅比较这3 个产地的情况。由图6、7可知,这3 个产地的茶叶间在3 个微生物指标上有着显著差异，福建茶叶在细菌总数和蜡样芽孢杆菌数上都比其他2 个产地低，湖北茶叶在细菌总数（（22 083±15 503） CFU/g）略微高于安徽茶叶（（21 154±12 191） CFU/g），但是其蜡样芽孢杆菌数量（（921±418） MPN/g）却略微低于安徽茶叶（（942±367） MPN/g）。而安徽又是所有产地中唯一检出克罗诺杆菌的省份。

微生物指标不仅与产地有关，与各地生产的品种也有很大的关系，如福建生产半发酵类茶（铁观音等），而湖北和安徽的不发酵茶和花草茶品种较多。正如2.4节所讨论，茶叶的种类对微生物指标影响很大。

3 讨 论

前期实验中曾同时采用MYP和PCA培养基直接稀释平板计数计算细菌总数和蜡样芽孢杆菌数量，发现部分样品中蜡样芽孢杆菌数量高于细菌总数。可能是因为MYP培养基是一种营养物质丰富的鉴别培养基，非常适合蜡样芽孢杆菌类细菌生长，而PCA是常规培养基的缘故。但是这样的结果没法测算蜡样芽孢杆菌占细菌总数的比例，故此改用了MPN法。MPN法中多数样品中蜡样芽孢杆菌数量都超出了MPN法的上限1 100 MPN/g，也不能精确计量蜡样芽孢杆菌数量。这2 种情况都反映出蜡样芽孢杆菌在茶叶样品数量变化较大，某些样品中所占比例非常高，属于优势菌群。特别是所有的发酵茶样品中蜡样芽孢杆菌均高于1 100 MPN/g，远远高于不发酵茶和半发酵茶，说明茶叶的发酵过程中蜡样芽孢杆菌数量有增长[18]。

本实验发现武汉地区市售茶叶中克罗诺杆菌检出率不高，阳性样品中含菌量也不高，未发现对婴幼儿高毒力的阪崎克罗诺杆菌，但是存在对成人（免疫力差人群）有感染能力的丙二酸盐克罗诺杆菌C. malonaticus[19]。

虽然本实验没有研究茶叶中大肠菌群的数量和类别，但是在鉴定5 株疑似克罗诺杆菌过程中发现其中2 株（也是花草茶样品分离株），并非克罗诺杆菌而是埃希氏菌属，可见一般认为对干燥敏感的肠杆菌科细菌在茶叶检出率并不低。

花草茶（包括谷类茶）现在品种越来越多，也受到市场追捧。但是实验发现，花草茶无论在细菌总数、蜡样芽孢杆菌和肠杆菌科细菌数量上都很高，甚至比传统的茶叶类还高。

传统饮茶习惯中极少发生微生物食物中毒的报道，但是随着各种花式茶（特别是奶茶）普及和茶粉等深加工产品添加到糕点等食品中，由于大量的糖、淀粉、蛋白质等营养丰富的原料加入，加上保质期的延长，可能给食源性致病菌提供了生长、产毒的机会，比如:蜡样芽孢杆菌在富含淀粉质食品中容易生长，并产生非常稳定的呕吐毒素引起呕吐型食物中毒[19]；而克罗诺杆菌食物中毒多数因乳品引起[20]。

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Detection and Analysis of Two Food-Borne Pathogens in Tea Samples from Wuhan Market

DOU Yumiao, ZHANG Fei, ZHANG Yi, CHEN Yaheng, ZHOU Guoping*
(School of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

The objective of this study was to detect the aerobic plate count, and isolate and identify two food-borne pathogens (Bacillus cereus and Cronobacter) in tea samples collecte d from local markets in Wuhan according to the Chinese national standards. Bacillus cereus was identifi ed by PCR analysis of 16S rDNA internal transcribed spacer (ITS) sequence and Cronobacter by 16S rDNA and fusA sequence analysis. We further compared the detection rates of both bacterial pathogens in tea samples from different producing areas and in different kinds of tea. Bacillus cereus was detected in 97.9% of the investigated tea samples accounting for about 6.0% of the total bacterial population. Three strains of Conobacter spp. were identifi ed in 6.5% of these tea samples accounting for only 0.1%–3.2% of the total bacterial population. The highest aerobic plate count and Conobacter spp. were found only in herbal tea. Fermented tea had the highest B. cereus counts, exceeding 1 100 MPN/g in all samples. There were signifi cant differences in the three microbial indicators among different tea-producing regions. Thus, the food safety hazards of these food-borne pathogens cannot be ignored, especially when tea is mixed with other materials.

tea; aerobic plate count; Cronobacter; Bacillus cereus; detection; identifi cation

Q939.97

A

10.7506/spkx1002-6630-201510039

2014-08-09

湖北省教育厅科学研究计划项目中青年项目(Q20111703)；武汉轻工大学研究生创新基金项目(2013cx020)；2014年武汉轻工大学大学生科研立项项目

窦玉淼(1992—),女,学士,研究方向为生物工程。E-mail：735359310@qq.com

*通信作者：周帼萍(1971—),女,副教授,博士,研究方向为微生物发酵与食品安全。E-mail：wjczgp@163.com