水溶性有机试剂萃取杜氏藻中的β-胡萝卜素

(北京联合大学应用文理学院食品科学系,北京 100191)

水溶性有机试剂萃取杜氏藻中的β-胡萝卜素

惠伯棣,许 岱,宫 平,高 洁

(北京联合大学应用文理学院食品科学系,北京 100191)

使用水溶性有机溶剂建立适用于杜氏藻中β-胡萝卜素萃取的方法。以乙酸乙酯为参比,用丙酮、甲醇、乙醇和四氢呋喃4 种水溶性有机溶剂,对实验室养殖的杜氏藻体在室温条件下分别进行萃取。用C18-高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)和C30-HPLC分别测定萃取物中β-胡萝卜素含量及其几何异构体的组成。通过比较不同溶剂萃取的β-胡萝卜素含量和所消耗的溶剂体积,筛选出适合食品工业生产中使用的水溶性萃取溶剂。在进一步考虑各溶剂的食品安全性之后,确定乙醇为最适溶剂。使用乙醇作为萃取溶剂,能够从每毫克(干质量)藻体中萃取得到β-胡萝卜素0.32 μg。其中,总顺式异构体的比例占20.21%(m/m)。随后,使用4 种碳水化合物和1 种蛋白质水解酶对藻体的细胞壁和膜进行破坏。观察原料酶解对β-胡萝卜素萃取量和溶剂消耗的影响。实验结果表明,原料酶解可导致其中β-胡萝卜素的损失,并对溶剂消耗无明显改进,不建议采用。

杜氏藻；β-胡萝卜素；水溶性有机溶剂；酶；几何异构；高效液相色谱

β-胡萝卜素是一种类胡萝卜素。其半系统命名和习惯命名分别为：β,β-胡萝卜素和β-胡萝卜素。β-胡萝卜素的分子由中央共轭双烯链和六元环末端基团组成。由于中央共轭双烯链中存在9 个共轭双键,β-胡萝卜素分子在理论上可存在多种几何异构体(E/Z-异构体)。在自然界中,常见的几何异构体包括全反式异构体和9-顺-异构体等。其中,全反式异构体分子具有对称结构,见图1。β-胡萝卜素为碳氢化合物,极性非常弱,故不溶于水,易溶于许多有机试剂。因此,其在极性弱的有机试剂(如苯和己烷等)中具有较好的饱和溶解度。β-胡萝卜素对酸、光和热都不稳定[1-2]。β-胡萝卜素的提取和制备方法是根据其分子结构特征和物理及化学性质而建立的。

全反式β-胡萝卜素具有在体内淬灭单线态氧和自由基的作用,可以抑制脂质过氧化,也可用于预防和治疗白内障等多种由衰老引起的退行性疾病。还有证据表明,β-胡萝卜素顺式异构体有预防和治疗心血管疾病和癌症等作用[3-7]。另外,全反式β-胡萝卜素是VA源,可治疗和缓解VA缺乏症[8]。因此,β-胡萝卜素被JECFA认定为A类食品营养强化剂,可合法使用在保健食品、食品添加剂、药品以及化妆品中。

杜氏藻(Dunaliella salina)属蓝藻界、绿藻门、多鞭藻科、盐生藻类属的单细胞光合藻类,又名盐藻,主要分布在盐湖、沿海盐池以及含盐量高的水中。杜氏藻呈梨形或卵形,具单核、叶绿体和一对较长的鞭毛,没有坚硬的细胞壁。杜氏藻细胞内可积累大量的类胡萝卜素,达细胞干质量的14%(m/m),其中大部分为β-胡萝卜素。因此,它成为了商业化生产天然β-胡萝卜素重要原料[9]。杜氏藻中β-胡萝卜素组分有一个显著的的特征：含有大量的顺式异构体。已有报道,我国内蒙地区生长的杜氏藻中含有11 种类胡萝卜素及几何异构体。其β-胡萝卜素主要包括：7-顺式、9-顺式、15-顺式、全反式4 种异构体[10]。

从杜氏藻中萃取类胡萝卜素的方法已有报道。石斌等[11]从藻粉中萃取类胡萝卜素时,首先将藻粉用4 g/100 mL的NaOH-甲醇溶液在60～70 ℃条件下皂化1 h,再用1∶1(V/V)的石油醚(沸程：60～90 ℃)与乙醇混合溶剂反复萃取,收集醚相,用水洗到中性,在50～60 ℃条件下减压浓缩,浓缩液过Al2O3或MgO柱,用石油醚与丙酮混合溶剂做洗脱剂,可得具有一定纯度的β-胡萝卜素组分。这种方法的优点在于萃取前可除去产物中的叶绿素,不足之处在于原料的碱处理可能导致制备成本的升高。对于新鲜原料,徐贵义等[12]先在藻液中加入FeCl3,使藻絮凝,静止后得到藻糊。在藻糊中直接加入乙酸乙酯,在40～50 ℃条件下进行萃取,蒸发浓缩萃取液,得到β-胡萝卜素晶体。这种方法的优点在于可以省去原料干燥步骤,不足之处在于萃取通过界面发生的,萃取过程的效率不易提高。还有报道[13]可用石油醚从干藻粉中直接萃取β-胡萝卜素,称取一定比例的藻粉和石油醚,加温至50 ℃,搅拌萃取2～3 次,蒸发浓缩萃取液,得到结晶产品。用氧化镁柱可有效地分离和纯化经过皂化的杜氏藻萃取物而得到较纯的β-胡萝卜素组分。制备物检测方法也是多样的[14-16]。

本研究的主要目的是采用水溶性有机溶剂做为萃取溶剂,发展一种从杜氏藻中萃取β-胡萝卜素的方法,力求在工业规模上可以避免脱水干燥。为此,在本项研究中,首先在实验室条件下培养杜氏藻,获得藻液,分别用4 种不同的水溶性有机溶剂直接进行萃取,采用紫外-可见分光光度法、C18-高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)、C30-HPLC进行组成分析,比较4 种有机试剂对β-胡萝卜素的萃取量和溶剂消耗。同时,观察用多糖水解酶和蛋白水解酶破壁对β-胡萝卜素含量和溶剂消耗的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜氏藻（Dunaliella salina）藻种 上海光语生物科技有限公司。

全反式β-胡萝卜素（C/N:22040-1G-F，纯度＞97%） 美国Sigma公司；海水盐 日本Formular Distributor股份有限公司；甲醇、四氢呋喃、乙醇、乙酸乙酯（均为分析纯） 北京化学试剂公司；丙酮（分析纯） 鼎国生物技术有限责任公司；乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）（均为色谱纯） 美国迪马公司；果胶酶（60 000 U/mL）、纤维素酶（100 000 U/mL）、木聚糖酶（70 000 U/mL）、β-葡聚糖酶（100 000 U/mL）、蛋白酶（60 000 U/mL）苏州昆蓝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

PU-2080 HPLC泵、UV-2075 HPLC检测器 日本Jasco公司；N2000色谱工作站 浙大智达信息工程有限公司；Carotenoid YMCTMC30色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 日本YMC公司；DiamonsilTMC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国迪马公司；Jebo 25W水草灯 广东振华电器有限公司；MLS-3750灭菌锅 日本Sanyo公司；RE52CS旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 培养液母液配制

按照表1所示配方配成母液A、B、C、D、E、F、G备用。用海盐和蒸馏水配成含盐量3%的人工海水。将人工海水和A、B、C、D、E、F母液放入高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。

1.3.2 藻的培养

杜氏藻藻种经培养（或稀释）后，用血球计数板测定密度达到（9～10）×108个/L。培养条件:温度20～23 ℃、pH 7.5；光源:日光灯；光照时间:14 h/d；光照强度:4 000 lx。在培养3～4 d后藻种颜色由浅变深。

依次加1 mL的A、B、C、D、E、F母液于1 L的人工海水中。用5 mL的一次性针头吸取G母液，经过0.45 μm滤膜过滤后加入1 mL于上述的人工海水中，配成工作液。取3 个150 mL的灭菌过的具塞三角瓶，每瓶中加入30 mL工作液。将藻种摇匀后用10 mL移液管向上述3 个三角瓶中分别移入10 mL藻种液，达到接种密度为藻种与培养液体积比1∶3。

扩培条件与藻种培养条件相同。每天摇瓶2～3 次，使藻种保持悬浮状态。藻液颜色由浅变深后（一般5 d）可进行第2次扩大培养。扩培的接种比例为藻液与培养液体积比1∶5。后期，扩培比例可达到1∶10（V/V）。

1.3.3 藻密度测定

采用血球板计数法测定培养液中藻密度。

1.3.4 藻干质量测定

取10 mL藻液，在2 500 r/min条件下离心10 min，弃去上清液。70 ℃条件下烘至质量恒定。减质量法测定干物质质量。

1.3.5 不同溶剂的萃取效率比较

取5支10 mL离心管，分别加入10 mL培养液。在2 500 r/min转速条件下离心10 min，弃去上清液。向各管中分别加入3.5 mL丙酮、甲醇、乙醇、四氢呋喃和乙酸乙酯。用涡旋振荡器振荡20 次，静置后收集第1次萃取液并定容至5 mL。再重复萃取2次，分别收集、定容萃取液。定容液过0.45 μm滤膜后用于C18-HPLC和C30-HPLC分析。重复6 次，取平均数计算结果。

1.3.6 原料酶解对萃取量和溶剂消耗的影响

将藻培养液分别置于50 mL离心管中，在2 500 r/min条件下离心10 min，弃去上清液，合并收集沉淀物。

取6 支10 mL离心管，每支中加入0.4 g沉淀物，再加入2 mL水和800 U的酶液，用涡旋振荡器振匀，45 ℃水浴保温2 h，其间每15 min用涡旋振荡器振匀一次。在2 500 r/min条件下离心10 min，弃去上清液。对照样品中用水代替酶液。向每个管中分别加入4 mL乙醇。用涡旋振荡器振荡20 次，静置后收集第1次萃取液并定容至5 mL。再重复萃取2 次，方法同前。定容液过0.45 μm滤膜后用于C18-HPLC和C30-HPLC的检测。重复6 次，取平均数计算结果。

1.3.7 β-胡萝卜素组分的C18-HPLC检测

采用惠伯棣等[17]的色谱条件：色谱柱：C18DiamonsilTM(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相A：乙腈-水(9∶1,V/V)；流动相B：乙酸乙酯；流速1 mL/min；检测波长：450 nm；进样量：20 μL；梯度：在20 min内,流动相B的含量由0%线性上升至100%。根据各组分的光谱特征和色谱行为与已发表的结果比较对其进行定性[17]。其中,借助全反式β-胡萝卜素参比样品,根据保留时间和光谱特征的一致性,对β-胡萝卜素组分定性。用参比样品制作由6点组成的标准曲线,R2大于99.6%。采用外标法定量分析β-胡萝卜素组分。

1.3.8 β-胡萝卜素组分几何异构体组成的C30-HPLC检测

检测方法采用惠伯棣等[18]的色谱条件:色谱柱C30YMCTMCarotenoid（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A:乙腈-甲醇（3∶1，V/V）；流动相B:MTBE；流速: 1 mL/min；检测波长:450 nm；进样量:20 μL；梯度: 8 min内，流动相B含量由0%线性上升到55%，之后流动相B的含量在55%维持27 min。根据各组分的光谱特征和色谱行为与已发表的结果比较对其进行定性[18]。根据各β-胡萝卜素异构体组分的峰面积计算β-胡萝卜素组分的异构体组成。

2 结果与分析

2.1 藻密度和干质量的测定

每次扩培前培养液中藻密度为9.43×108个/L。每升藻液中含有的干物质质量为0.45 g。

2.2 β-胡萝卜素组分在C18-HPLC上分离

图2表明，杜氏藻提取物的C18-HPLC行为与来自高等植物光和组织的相似。根据色谱图上各组分的保留时间、洗脱顺序和光谱特征与已发表的来自高等植物光和组织萃取物的比较，杜氏藻萃取物中各组分定性的推测结论见表2。5 种试剂萃取液中均出现6 个主要的峰。在本项研究中，依据各组分的洗脱顺序和紫外-可见光谱图与已发表的数据比较，对C18-HPLC图上的4 个组分进行了定性:叶黄素、叶绿素C和D以及β-胡萝卜素。除上述4 个化合物外，依据光合生物萃取物在C18柱上的保留时间段，本实验对其他组分的结构描述只限于指出其含氧与否[17]。实验结果表明，四氢呋喃和乙醇萃取液中叶黄素和β-胡萝卜素含量较高。乙酸乙酯萃取液中β-胡萝卜素最低。在色谱图上的6 个峰中，叶黄素所占比例最大。这可能是由于在培养过程中，杜氏藻所处的外界环境条件优越，进行了大量的光合作用。而β-胡萝卜素是叶黄素合成的前体。当其处于恶劣的环境中时，便会积累大量的β-胡萝卜素。

已有的证据表明，在C18-HPLC中，不同的β-胡萝卜素几何异构体不能得到有效的分离。换言之，在本项研究的色谱条件下，在C18-HPLC上得到的β-胡萝卜素组分是其几何异构体的混合物，可称总β-胡萝卜素组分。图2表明，萃取物中β-胡萝卜素组分与其他组分得到了良好的分离。这使β-胡萝卜素组分的定量具有了可行性。在此色谱条件下，用β-胡萝卜素参比样品制作标准曲线，R2超过99.96%。

2.3 β-胡萝卜素中几何异构体的分离

如图3所示,在本研究的色谱条件下，在C30-HPLC上，不同的β-胡萝卜素几何异构体能得到有效的分离[18-19]。根据色谱图上各组分的保留时间、洗脱顺序和光谱特征与已发表的来自高等植物光和组织萃取物的比较，杜氏藻萃取物中各组分定性的结论见表3。图3表明，萃取物中β-胡萝卜素组分中几何异构体与其他组分得到了良好的分离。这使β-胡萝卜素组分中几何异构体的定量具有了可行性。

2.4 不同溶剂萃取的β-胡萝卜素含量比较

与乙酸乙酯比较，用乙醇和四氢呋喃做溶剂，在3 次萃取后β-胡萝卜素含量较高，见图4。用四氢呋喃作为萃取溶剂时，得率最高。文献检索的结果表明，不含氧类胡萝卜素在四氢呋喃中有较好的饱和溶解度。因此，这一结果与已有的报道[20-21]一致。而不含氧类胡萝卜素在乙醇中的饱和溶解度有限。形成本项研究结果的原因可能是萃取溶剂中来自样品本身的脂溶性组分起到的助溶作用。这需要进一步的实验来证明。

2.5 不同溶剂萃取物中β-胡萝卜素几何异构体组成比较

将5 种不同试剂的3次杜氏藻萃取液用C30-HPLC分离后,根据各组分的色谱行为和光谱特征与已发表的文献所报道的结果作比较[18-19,22],可以观察到,萃取液中均含有9-顺-β-胡萝卜素、13-顺-β-胡萝卜素和全反式β-胡萝卜素。其中,以全反式β-胡萝卜素为主,13-顺-β-胡萝卜素的量极小,定量困难。这与已有的报道[23-25]相符。图5表明,溶剂种类对萃取物中β-胡萝卜素几何异构体组成影响不大。

2.6 不同溶剂萃取的溶剂消耗比较

图6显示了每次萃取的β-胡萝卜素含量。与乙酸乙酯比较,用乙醇和四氢呋喃做溶剂,第1次萃取液中的β-胡萝卜素含量明显多于第2、3次萃取液中的β-胡萝卜素含量。这表明乙醇和四氢呋喃做溶剂时,溶剂消耗量较少。与之明显不同,乙酸乙酯第1次与第2次萃取液中β-胡萝卜素含量相差不多。这说明用乙酸乙酯作溶剂的溶剂消耗量大。可以观察到：4 种试剂在第3次萃取液中所萃取出的β-胡萝卜素含量急剧下降。因此,可以认为4 种溶剂经过3 次萃取基本可达到完全萃取。

2.7 乙醇做萃取溶剂的合理性依据

考虑到四氢呋喃和丙酮会给产品带来不愉快的味道,甲醇的食品安全性较差,故不建议使用。乙醇是GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》所列出的合法使用加工助剂,因此成为在工业规模的实践中适合的萃取溶剂。按干物质含量折算后,从每毫克干质量藻体中可萃取到β-胡萝卜素0.32 μg。其中总顺式异构体占20.21%(m/m)。

2.8 原料预处理对萃取效率的影响

由于植物和藻类细胞壁和细胞膜化学组成包括多种碳水化合物和蛋白质,在萃取前使用碳水化合物和蛋白水解酶水解细胞壁和细胞内部的膜结构以改进萃取效率已成为中药和天然产物萃取技术中普遍采用的原料前处理内容。在本研究中,4种多糖水解酶和1 种蛋白质水解酶被用来尝试破坏藻的细胞壁和膜。图7显示,所有经过酶处理的样品经过3 次乙醇萃取所得总β-胡萝卜素含量均低于对照样品。出现这种现象的原因是酶解破坏细胞壁和膜可使藻体内的β-胡萝卜素暴露导致损失；可以认为木聚糖酶对细胞结构的破坏效果最强,导致藻体内β-胡萝卜素的暴露程度最高,损失率也最高。

图8显示,与对照样品相比,所有经过酶处理的样品的第1次乙醇萃取所得的β-胡萝卜素含量差别不大。换言之,用酶处理原料对提高萃取效率、减少溶剂消耗的作用不明显。

因此,在从杜氏藻中萃取β-胡萝卜素的过程中,为防止萃取物的损失,不建议采用酶解预处理原料的措施。

3 结 论

杜氏藻在实验室条件下扩培、生长情况良好。用4种水溶性有机溶剂做为第一萃取溶剂,萃取其中的β-胡萝卜素组分。用四氢呋喃和乙醇做为萃取溶剂可获得较高的β-胡萝卜素含量,并使用较少的溶剂体积。从食品安全性的角度考虑,建议在工业规模上采用乙醇作为萃取溶剂。使用酶解法可破坏原料的组织和细胞结构,有利于改善萃取效率。但在酶解过程中,β-胡萝卜素有一定的损失。因此,在工业生产中不建议使用。

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Extraction of β-Carotene from Dunaliella salina by Water-Soluble Organic Solvent

HUI Bodi, XU Dai, GONG Ping, GAO Jie
(Department of Food Science, College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

This study aimed to develop a method for β-carotene extraction from Dunaliella salina by water-soluble organic solvents. In experiments, in reference to ethyl acetate, four water-soluble organic solvents, namely acetone, methanol, ethanol and tetrahydrofuran, were selected as media to extract β-carotene from Dunaliella salina cultured under laboratory conditions. β-carotene and its geometrical isomers in each extract were determined by C18-HPLC and C30-HPLC, respectively. By comparing the extraction efficiency of β-carotene and solvent consumption and meanwhile considering food safety, ethanol was selected as the most suitable medium for industrial practice. By using ethanol as the extraction medium, 0.32 μg of β-carotene was extracted from 1 mg of dried Dunaliella salina with 20.21% (m/m) of total Z-isomers. Four carbohydrates and one protease were then employed to destroy the cell wall and membrane of algae. The influences of enzymatic hydrolysis of raw material on the extraction efficiency of β-carotene and solvent consumption were observed. Data obtained from this investigation suggested that enzymatic hydrolysis of Dunaliella salina resulted in loss of β-carotene amount and exhibited no improvement in solvent consumption. It is therefore not considered to be applied.

Dunaliella salina; β-carotene; water-soluble organic solvent; enzyme; geometrical isomer; HPLC

TS202.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201510036

2014-10-18

惠伯棣(1959—),男,教授,博士,研究方向为类胡萝卜素化学及生物化学。E-mail：bodi_hui@buu.edu.cn