N MR 氢谱定量测定奶酪中总共轭亚油酸的含量

(北京市食品安全监控和风险评估中心,北京 100041)

N MR 氢谱定量测定奶酪中总共轭亚油酸的含量

李 玮,姜 洁,路 勇,何 涛,李 龙,王 振

(北京市食品安全监控和风险评估中心,北京 100041)

目的:建立用核磁共振定量法测定奶酪中总共轭亚油酸含量的方法，并与紫外分光光度法进行比较。方法:以1,2,4,5-四甲基苯为内标，采用5 mm BBO探头、脉冲序列noesyig1d、探头温度300 K、扫描次数128 次、脉冲延迟时间（D1）10 s。结果:该方法的加样回收率为93.33%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为4.20%；精密度RSD为0.99%，重复性RSD为3.17%，稳定性RSD为1.81%。结论:该方法前处理简单，无需标准品做参比，在对目标物完成定性、定量分析的同时还可以实现对非目标物的定性分析。与紫外分光光度法相比，该方法具有更好的专属性。

核磁共振定量法；奶酪；共轭亚油酸；定量测定

共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是一类含有共扼双键的十八碳二烯酸（亚油酸）同分异构体的总称[1]。天然来源的CLA主要存在于反刍动物的肉及乳制品中，是人体不可缺少的脂肪酸之一。近年来的研究表明，CLA具有抗癌[2-5]、抗动脉粥样硬化[6-11]、增强机体免疫力[12]、促进骨形成等多种生理功能[13]。其中起关键作用的2 种主要异构体为c9,t11-CLA和t10,c12-CLA，在乳制品中这2 种异构体分别占总CLA的75%～90%和5%。

乳制品是人体日常摄入CLA的主要来源，而奶酪是具有极高营养价值的浓缩乳制品，被誉为乳品中的“黄金”。随着国内市场对奶酪制品消费量的大幅增加，建立一种快速、准确、简便的奶酪等乳制品中的CLA定性和定量分析方法十分必要。目前针对CLA的分析方法主要有紫外分光光度法[14-15]、高效液相色谱法[16]、气相色谱法[17-18]等。但这些方法存在着前处理过程操作繁琐、费时，样品和试剂消耗量大，会受到其他成分信号的干扰等缺点。核磁共振定量（quantitative nuclear magnetic resonance，QNMR）分析方法以结构测定为基础，具有前处理过程简单，取样量小，专属性强，无需对照品做参比即可同时定性、定量等优点，已被广泛的用于药物分析[19-20]、食品科学[21-22]等研究领域。本研究采用1H-NMR内标定量法，建立了无需对照品的快速、专属、简单的奶酪中总CLA含量的测定方法，考察了实验条件的影响，用绝对定量和标准曲线模式测定了7 种市售奶酪样品中总CLA的含量，并与紫外分光光度法进行了比较，为奶酪等乳制品的品质评价提供了新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

7 种奶酪样品购于北京市超市，置于4 ℃冰箱保存。

正己烷（分析纯） 北京化工厂；标准品:1,2,4,5-四甲基苯、c9,t11-CLA、t10,c12-CLA（纯度≥99%）美国Sigma公司；氘代氯仿（CDCl3，氘代度:99.8%）美国CIL公司。

1.2 仪器与设备

AVANCE 600MHZ超导傅里叶变换NMR仪（配有BBO探头和Topspin 3.2处理软件） 瑞士Bruker公司；Lambda 35紫外分光光度计 美国Perkin Elmer公司；XS204电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；TissueLyserⅡ均质器 德国Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

称取适量的1,2,4,5-四甲基苯标准品，用CDCl3溶解并定容，摇匀，制得0.2 mg/mL的内标储备液。称取c9,t11-CLA、t10,c12-CLA标准品各25 mg置于同一5 mL棕色容量瓶中，用CDCl3溶解并定容，摇匀，制得10 mg/mL的标准品储备液，-20 ℃冰箱中储存备用。

1.3.2 供试品溶液的制备

称取奶酪样品约1 0 0 m g于离心管中，加入1 mL CDCl3后置于均质器中均质30 s（30 Hz），过滤。分别移取500 μL样品滤液和100 μL内标储备液于5 mm核磁管中，制得供试品。

1.3.3 NMR测定条件

1H-NMR、1D-TOCSY、1H-H COSY、HSQC、HMBC使用Bruker标准脉冲程序，检测温度均为300 K，扫描次数（scanning number NS）分别为128、32、8、8、80 次，1D-TOCSY的混合时间D9设为0.075 s。1D-TOCSY为一维选择性实验技术，在混合物解析中发挥着重要作用，能够得到激发核以及与其在同一个自旋体系的质子的信号；1H-H COSY技术能够给出相邻碳上氢的关系，HSQC技术能给出直接相连的碳氢关系；HMBC技术能给出远程耦合的碳氢关系。

定量实验:使用Bruker标准实验参数ASSURE-1H，脉冲序列Noesyig1d，检测温度300 K，1H的90°脉冲宽度P110.32 μs，谱宽7 211.54 Hz，中心频率2 700.59 Hz，脉冲延迟时间D1为10 s，混合时间D80.01 s，13C的去耦序列90°脉冲260 μs，扫描次数128次，空扫次数4次。

1.3.4 供试品溶液的测定

测定前，使用标准管（90% H2O+10% D2O）对仪器进行3D匀场，使用ASTM标准管精确校准探头90°脉冲宽度。在1.3.2节测定条件下，测定供试品的1H-NMR谱图。所有图谱使用Bruker Topspin 3.2软件处理，变换点数为96 000，用指数窗函数处理，LB为1.00 Hz，基线和相位校正均采用手动方式进 行。每个供试品的积分面积取5 次积分的平均值。按以下公式计算供试品中CLA的绝对含量。

式中:W为物质的质量/mg；A为定量峰积分面积；N为定量峰所包含的质子数；M为物质相对分子质量；下标u及r分别为分析物和内标物。本实验中的Nu=1，Nr=2，Mu=280.44，Mr=134.22，Wr=0.02 mg。

1.3.5 标准溶液的配制及曲线绘制

准确吸取80、50、20、10、5 μL标准储备液，分别置于已加有100 μL内标储备液的5 支核磁管中，各加一定体积的CDCl3溶液至500 μL，配制成含质量分别是0.8、0.5、0.2、0.1、0.05 mg的标准样品，以1.3.3节中的测定条件进行1H-NMR分析。以积分得到的标准品定量峰面积与内标峰峰面积比值为Y轴，以加入标准品质量与加入的内标质量的比值为X轴做标准曲线。

1.3.6 紫外分光光度法测定

用正己烷配制成质量浓度为2、5、8、10、20 μg/mL的一系列CLA对照品溶液，按照紫外-可见分光光度法，在234 nm波长[14-15]处测定吸光度，绘制标准曲线。称取奶酪样品约100 mg于离心管中，加入1 mL正己烷后，置于均质器中均质30 s（频率为30 Hz），过滤。吸取500 μL样品滤液于25 mL容量瓶中，加适量正己烷定容，摇匀。吸取适量溶液，在234 nm波长处测定吸光度，根据所得标准曲线计算样品中CLA的含量。

2 结果与分析

2.1 定量特征峰、定量内标的选择

测定供试品溶液的1H-NMR谱，结果见图1。其中，δ0.50～2.50（图1a）信号为CLA和其他脂肪酸的饱和质子信号，δ4.10～4.36（图1b）和δ5.27（图1c）信号为甘油三酯中丙三醇的质子信号，δ5.30～5.43（图1d）信号为非共轭脂肪酸不饱和质子信号，这些信号相互堆积重叠，不易辨识。由于共轭系统的存在，CLA的4 个共轭不饱和质子出现在低场区（δ5.20～6.50），其中δ5.33的质子信号被非共轭脂肪酸不饱和质子信号覆盖，余下3 个共轭不饱和质子信号（δ5.67、δ5.96和δ6.30）与其他脂肪酸信号无重叠，易于辨认。供试品及标准品的检测结果显示，δ5.67信号积分面积值不稳定，并结合文献[23-24]报道，选择δ5.96（图1e）和δ6.30（图1f）2 个质子信号峰作为定量峰，最终以这2 个质子信号积分面积的均值作为计算供试品中总CLA含量的定量积分面积值。

QNMR所选内标应满足纯度高，能与被测样品溶于同一种溶剂，不与被测样品及溶剂反应，定量信号峰易于识别，并且至少要保证有一组峰与被测物完全分离等要求。因此，本实验选用1,2,4,5-四甲基苯为定量内标，其苯环上的2 个质子在化学位移为δ6.92（图1g）处有一尖锐单峰（1H-NMR CDCl3），故选定此峰为内标定量特征信号峰。

2.2 QNMR定量参数考察

脉冲延迟时间的考察:取1.3.5节中制备的含0.1 mg标准品核磁管，分别设D1为2、4、8、10、15、20 s，NS为48 次，余下参数按1.3.3节下条件上机检测，考察D1对定量峰与内标峰积分面积比值（AS为CLA两个定量信号积分面积的均值；AR为内标定量信号积分面积）的影响，结果见表1。结果显示，当D1≥10 s时，相对积分面积稳定，因此，确定实验的D1为10 s。

扫描次数的考察:取1.3.5节中制备的含0.1 mg标准品核磁管，分别设NS为8、16、32、48、64、128、256 次，余下参数按1.3.3节下条件上机检测，考察NS对定量峰RSN的影响，结果见表2。在NMR定量实验中，NS较少会造成数据重复性差，较多会使数据重复性好，提高信噪比，但同时也会延长实验时间。综合考虑，本实验中取NS为128 次，此时定量峰的RSN大于100。

2.3 线性关系

以积分得到的标准品定量峰面积与内标峰面积比值为纵坐标（AS/AR）为纵坐标，以加入的标准品质量与加入的内标质量的比值为横坐标做线性回归。在标准品与内标质量比为2.5～40范围内，得回归方程y = 3.847 9x+ 0.406 8，R² = 0.999 9，表明本方法线性关系良好。

2.4 精密度

将按1.3.2节方法制备的供试品在1.3.3节下条件平行测定6 次，计算样品中AS/AR的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.99%。确认方法精密度良好。

2.5 重复性

按1.3.2节下方法平行制备6 份供试品溶液，在1.3.3节条件下测定1H-NMR图谱，计算样品中AS/AR的RSD为3.17%，确认方法重复性良好。

2.6 稳定性

取同一供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24、48 h，在1.3.3节条件下测定1H-NMR图谱，计算各时间点图谱AS/AR的RSD为1.81%，确认供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7 加标回收率

平行称取同一品牌的奶酪样品9 份，其中3 份作为对照，另外6 份各加入10 μL质量浓度为10 mg/mL的标准储备液。按1.3.2节下方法制备供试溶液，在1.3.3节条件下测定1H-NMR图谱，计算回收率和RSD，结果见表3。

2.8 样品测试结果

称取不同品牌的奶酪样品,每个品牌3 个平行(n=3),制备供试品溶液,测定1H-NMR图谱,并计算样品中CLA的含量。再采用紫外分光光度法测定样品中CLA的绝对含量,结果见表4。

结果显示，NMR绝对定量法和NMR标准曲线法所得到的结果基本相符（RSD在4%以内）；所有样品的紫外分光光度法的检测值均大于NMR绝对定量法的检测值，其中1、3、5号样品的紫外分光光度法的测定值明显大于对应的NMR绝对定量法测定值（RSD大于20%）。通过对比1号样品和2号样品的1H-NMR图谱（图2），发现1号样品在δ5.20～7.40范围有几组多出信号，其中δ7.32（dd, 10.8, 15.2 Hz）、δ5.80（d, 15.2 Hz）耦合常数在15 Hz左右，具有典型的反式双键上质子特征。1D-TOCSY技术能够得到激发核以及与其在同一个自旋体系的质子的信号，而非该自旋体系的其他质子信号则不出现在谱图中。对1号样品采用1D-TOCSY技术，选择性照射δ7.32的质子，得出δ7.32、δ6.21、δ5.80、δ1.88信号质子处于同一自旋体系内（图3）。1H-NMR谱δ6.21处的信号为多重峰，不易辨识，通过HSQC，得出此处的多重峰为2 个质子谱峰的重叠，化学位移分别为δ6.22和δ6.20（图4），并且进一步得出δ146.8、δ129.8、δ139.8、δ117.75、δ18.6碳原子分别与δ7.32、δ6.22、δ6.20、δ5.80、δ1.88质子直接相连。通过1H-1H COSY图谱，可以观察到δ7.32处信号分别与δ6.22及δ5.80两个信号峰相关，δ6.20信号峰和δ1.88信号峰相关（图5），得出5 个质子的连接顺序。HMBC谱中，δ7.32、δ5.80 2 个质子均与δ169.8的碳信号相关（图6），结合δ5.80质子信号的峰形，推断此双键中δ117.75的碳与羧基相连。结合质谱测定结果，确认此成分为山梨酸（2,4-己二烯酸，图7）。3、5号样品的1H-NMR图谱与1号样品相似，说明其中也含有山梨酸成分。

紫外分光光度法是利用CLA中存在的共轭双键在234 nm波长处有特征吸收，而非共轭亚油酸及其他脂肪酸在该波长处没有吸收的原理来测定样品中CLA含量的。由于山梨酸分子中也含有共轭双键结构，在234 nm波长处同样有吸收，所以最终导致1、3、5号样品紫外分光光度法测定的CLA值显著偏高。2、4、6、7号样品的紫外分光光度法的检测值也均大于NMR绝对定量法的检测值，考虑到检测样品成分复杂性，并结合紫外分光光度法的特点，推测可能是样品中也含有在测定波长处具有紫外吸收的杂质。

3 结 论

目前的文献报道多见以QNMR内标法对药物制剂或化学对照品进行含量测定[25-26]，少见对食品中的营养成分进行绝对含量测定的文献报道。本实验以1,2,4,5-四甲基苯为内标，建立了奶酪中总CLA含量的QNMR分析方法。9c,11t-CLA、10t,12c-CLA标准品的1H-NMR（CDCl3）测定结果显示，两者所含的4 个共轭质子信号完全相同，并且乳制品中的CLA以这2 种异构体为主，因此，本实验中选取的定量峰能够代表样品中总CLA的含量。结果表明，本方法精密度、稳定性、重复性良好，专属性高，样品前处理简单，无需高纯度标准品做参比，可同时完成定性和定量分析。

与NMR定性图谱相比，QNMR实验对图谱的质量要求更高。由于13C自然丰度远低于1H，所以在1H-NMR图谱中13C对1H的耦合作用较小。因此，在对药物制剂、化学对照品这类基质简单，分析物的相对含量较高的样品进行分析时，常采用zg、zg30等不对碳去耦的脉冲序列进行实验。但本实验中的分析对象的基质复杂，目标分析物CLA的相对含量较低，对图谱的峰形、基线、相位的质量要求更高。因此，本实验采用Noesyig1d脉冲序列，对13C去耦，能够消除样品1H-NMR信号的卫星峰，增加定量准确性，同时还能提高基线平滑度，更适合复杂基质中微量成分的QNMR定量。

紫外光谱仪器较NMR仪价格便宜，普及率高，但易受其他成分的干扰，专属性较差。NMR测定结果与紫外分光光度法测定结果的比较显示，NMR的抗干扰能力明显优于紫外法。因此在进行CLA分析时，应充分考虑样品的性质和各分析方法的特点等来选择佳的检测方法。特别是对使用山梨酸作为防腐剂的食品样品进行CLA含量测定时，要避免使用紫外分光光度法。同时，由于QNMR法以结构测定为基础，除了能完成对目标物的分析外，还能够结合多种1D、2D-NMR技术，进一步给出非目标物的结构信息，完成对待测样品中非目标物的筛查和定性分析，使被动检测风险变为主动的发现风险，为食品安全监控工作提供了一条新思路。

[1] JOHN K G K, PETER W P, ROBCRT G J, et al. Rumenic acid: a proposed common name for the major conjugated linoleic acid isomer food in nature products[J]. Lipids, 1998, 33(8): 835.

[2] MA Yanxia, GUO Zheng, SUN Tao. CGRP inhibits norepinephrine induced apoptosis with restoration of Bcl-2/Bax in cultured cardiomyocytes of rat[J]. Neuroscience Letters, 2013, 549: 130-134.

[3] 董贵成, 曹丽霞, 那日苏, 等. 共轭亚油酸对癌的抗性及机制探索[J].食品科学, 2008, 29(1): 448-451.

[4] 黄桂东, 陈燕, 曹郁生. 共轭亚油酸诱导人结肠癌细胞Caco-2凋亡的作用[J]. 天然产物研究与开发, 2008, 20(6): 993-996; 1039.

[5] 宋琳亮. Bel7402 肝癌细胞中共轭亚油酸异构体通过不同机制下调COX-2表达[J]. 现代预防医学, 2007, 34(6): 1007-1009.

[6] 衣丹, 林学政, 沈继红, 等. 共轭亚油酸降血脂及抗动脉粥样硬化作用的研究[J]. 现代生物医学进展, 2011, 11(7): 1228-1230.

[7] MORAN-VALERO M I, MARTIN D, TORRELO G, et al. Phytosterols esterifi ed with conjugated linoleic acid. In vitro intestinal digestion and interaction on cholesterol bioaccessibility[J]. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2012, 60(45): 11323-11330.

[8] 薛秀恒, 王志耕, 王菊花, 等. 共轭亚油酸强化乳对小鼠体脂及血脂的影响[J]. 营养学报, 2006, 28(2): 120-123.

[9] 张若曦, 苑望, 伍晓雄, 等. 共轭亚油酸对高脂血症大鼠脂质代谢及visfatin基因表达水平的影响[J]. 中国实验动物学报, 2009, 17(6): 452-456.

[10] 衣丹, 李光友, 刘发义, 等. 共轭亚油酸对血管内皮细胞的保护作用[J].中国海洋药物杂志, 2009, 28(1): 17-19.

[11] 范亚苇, 邓泽元, 李静. 共轭亚油酸对动脉粥样硬化大鼠组织脂肪酸组成的影响[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 580-584.

[12] 王璇琳, 檀英霞, 郁成雨, 等. 自制酸奶乳脂中c9,t11-共轭亚油酸对小鼠免疫调节作用的影响[J]. 食品科学, 2010, 31(5): 288-292.

[13] MIZANUR R, ARUNABH B, JAMEELA B, et al. Conjugated linoleic acid protects against age-associated bone loss in C57BL/6 female mice[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2007, 18(7): 467-474.

[14] 左文杰, 刘波, 叶六一, 等. 植物油中共轭亚油酸紫外分光光度检测方法的研究[J]. 粮食科技与经济, 2012, 37(4): 17-19.

[15] 周小玲, 孙红专, 赵奋飞, 等. 驴乳中共轭亚油酸含量研究[J]. 乳业科学与技术, 2012, 35(3): 118-120.

[16] WILLIAM W C, GARY D, RICHARD O A. A practical guide to the isolation, analysis and identification of conjugated linoleic acid[J]. Lipids, 2007, 42(12): 1073-1084.

[17] PRANDINI A, SIGOLO S, PIVA G. A comparative study of fatty acid composition and CLA concentration in commercial cheeses[J]. Journal Food Composition and Analysis, 2011, 24(1): 55-61.

[18] 刘丽君, 李翠枝, 梁艳, 等. 气相色谱法检测牛奶及奶粉中共轭亚油酸[J]. 乳业科学与技术, 2013, 36(5): 32-34.

[19] HOLZGRABE U, DEUBNER R, SCHOLLMAYER C, et al. Quantitative NMR spectroscopy-applications I drug analysis[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 38(5): 806-812.

[20] 张烨, 刘小鹏, 张友杰. 水溶性维生素核磁共振定量分析研究[J]. 波谱学杂志, 2011, 28(3): 357-365.

[21] 阎政礼, 杨明生, 李添宝, 等. 蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖NMR定量分析研究[J]. 食品科学, 2009, 30(14): 253-255.

[22] 李爱平, 李震宇, 邢婕, 等. 核磁共振代谢组学技术检测食醋化学成分[J]. 食品科学, 2013, 34(12): 247-253. doi:10.7506/spkx1002-6630-201312051.

[23] MARIA R M, COLNAGO L A, FORATO L A, et al. Fast and simple nuclear magnetic resonance method to measure conjugated linoleic acid in beef[J]. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2010, 58(11): 6562-6564.

[24] SCHRIPSEMA J. Comprehensive analysis of polar and apolar constituents of butter and margarine by nuclear magnetic resonance, reflecting quality and production processes[J]. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2008, 56(8): 2547-2552.

[25] 张秀丽, 王聪任, 素梅宋, 等. 缓释胶囊中布洛芬含量的核磁共振波谱定量分析方法研究[J]. 中国海洋药物, 2014, 33(1): 11-16.

[26] 韦英亮, 潘艳坤, 杨益林. 有机标准物质期间核查核磁共振定量分析仪器参数的研究[J]. 化学分析计量, 2013, 22(2): 70-73; 87.

Determination of Total Conjugated Linoleic Acid Content in Cheeses by Quantitative Nuclear Magnetic Resonance (QNMR)

LI Wei, JIANG Jie, LU Yong, HE Tao, LI Long, WANG Zhen
(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment, Beijing 100041, China)

Objective: To establish a method for the determination of total conjugated linoleic acid (CLA) content in cheeses by quantitative nuclear magnetic resonance (QNMR) and to compare its effectiveness with that of ultraviolet spectrophotometry. Methods: The analysis employed 1,2,4,5-tetramethylbenzene as internal standard, and a 5-mm Bruker broadband observe (BBO) probe, working at 300 K with a pulse sequence of Noesyig1d, 128 scans and a pulse delay time (D1) of 10 s. Results: The recovery rate was 93.33% with relative standard deviation (RSD) of 4.20%. The precision RSD was 0.99%, the reproducibility RSD was 3.17% and the stability RSD was 1.81%. Conclusion: This method enables direct determination of target and non-target compounds in foods without using standard reference. Compared with ultraviolet spectrophotometry, it had a higher specifi city.

quantitative nuclear magnetic resonance (QNMR); cheeses; conjugated linoleic acid (CLA); quantitation

TS201.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510027

2014-09-15

首都食品安全科技创优培育专项(Z141100002614013)；北京市优秀人才培养资助项目(20140000204400001)

李玮(1984—),女,高级工程师,博士,研究方向为食品营养与安全。E-mail：liwei@bjmu.edu.cn