120 ℃条件下模型体系烤牛肉风味的形成

刘森轩,彭增起,吕慧超,李君珂,王复龙,崔保威,刘世欣

(食品安全与营养协同创新中心,南京农业大学食品科技学院,江苏 南京 210095)

120 ℃条件下模型体系烤牛肉风味的形成

刘森轩,彭增起*,吕慧超,李君珂,王复龙,崔保威,刘世欣

(食品安全与营养协同创新中心,南京农业大学食品科技学院,江苏 南京 210095)

以牛肉酶解液为底物，通过添加糖、氨基酸和硫胺素进行美拉德反应，研究烤牛肉风味形成的最佳酶解条件和添加物配比。通过正交试验确定牛肉最优酶解条件为:酶解温度50 ℃、酶解pH 6.5、m（风味蛋白酶）∶m（复合蛋白酶）=1∶1、加酶量质量分数8%、酶解时间50 min；析因试验确定美拉德反应模型体系最优配比为牛肉酶解液20 g、葡萄糖1.0 g、甘氨酸0.8 g、硫胺素0.3 g，120 ℃、pH 7.5条件下反应90 min。气相色谱-质谱法分析结果表明，该模型体系烤牛肉特征风味物质（2-甲基-3-呋喃硫醇、2-甲基四氢噻吩-3-酮、双（2-甲基-3-呋喃基）二硫）相对含量较高。感官评定表明，该模型体系褐变程度高，吸光度最高为0.263，且肉香纯正，烤牛肉风味浓郁。

牛肉酶解；美拉德反应；烤牛肉风味；气相色谱-质谱法

牛肉含有重要的营养物质，对人体健康具有很大的益处[1]，而传统烤牛肉制品因其独特的颜色、香气和口感也受到广大消费者的青睐。虽然烤牛肉味道鲜美，但通常烧烤温度在190～260 ℃条件下易产生杂环胺[2]、3,4-苯并芘[3]等具有致癌、致畸、致突变作用的物质。因此开展关于烧烤风味形成的研究，对保持烧烤肉制品独特诱人风味的同时降低其带来的危害具有重大意义。

熟肉风味物质不是单一化合物作用的结果，而是多种不同组成物质在数量上微妙平衡的产物，其显著特征是以含硫化合物为主[4-5]。有研究表明，美拉德反应、脂质氧化和硫胺素的降解在烤肉风味形成过程中起到重要作用[6]，而美拉德反应在牛肉烤制过程中对色泽和风味变化起到了非常重要的作用[7-8]，Mottram[9]研究发现美拉德反应的Strecker降解阶段会产生多种醛类化合物，随后产生的呋喃类、吡嗪类、噻吩类物质也是重要的香味物质成分。

本研究以牛背最长肌为原料，利用复合蛋白酶和风味蛋白酶2 种酶[10-11]对其进行水解，通过考虑酶解温度、酶解时间、酶解pH值、酶配比及加酶量5 个因素，找出最佳牛肉酶解工艺；再以牛肉酶解液为底物，设计美拉德反应析因试验，通过研究葡萄糖、甘氨酸和硫胺素的添加量对反应产物褐变程度和感官品质的影响，确定形成烧烤风味的最佳物质配比，探索温和条件下（120 ℃）烤牛肉风味的形成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛背最长肌（江苏黄牛）购于南京市玄武区卫岗农贸市场。

氢氧化钠、甲醛、盐酸（均为分析纯） 南京化学试剂有限公司；复合蛋白酶、风味蛋白酶、葡萄糖、甘氨酸、硫胺素（均为食品级） 河南金润食品添加剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1Litre组织捣碎机 德国Waring Commerical公司；HH-600三用恒温水箱 金坛市杰瑞尔电器有限公司；Allegra 64R型高速冷冻台式离心机、DU 730型紫外-可见分光光度计 美国Beckman Coulter有限公司；DGG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；HJ-3型数显恒温磁力搅拌器 金坛市宏凯仪器厂；AL 104电子分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；8400全自动凯氏定氮仪 上海展仪仪器设备有限公司；SCION SQ 456-GC气相色谱-质谱联用仪美国Brüker公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉中总氮含量的测定

采用全自动凯氏定氮仪进行测定[12]。将解冻的牛肉样品剔除可见脂肪、肌内膜和肌间膜并绞碎，称取0.2 g上述样品以及1 块消化片（硫酸钾和硫酸铜混合物）和12 mL浓硫酸于消化管中，消化1.5 h（420 ℃），用凯氏定氮仪测定样品中氮的含量。

1.3.2 牛肉酶解正交试验设计

根据前期试验结果[13]，选定酶解温度（A）、酶解时间（B）、酶解pH值（C）、酶配比（D）、加酶量（E），5 个因素为正交试验研究对象，每个因素设4 个水平，如表1所示，根据因素水平个数选择相应的正交试验表，进行试验，每组试验2 次重复，3 个平行。

1.3.2.1 牛肉酶解液的制备

取适量牛肉，剔除可见脂肪，置于高速组织捣碎机10 000 r/min处理1 min。称取肉糜10 g，移入三角瓶中，加入一定量蒸馏水，底物质量分数30%左右，升温至90 ℃热变性处理10 min，冷却后用0.1 mol/L氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH值，加入适量复合蛋白酶和风味蛋白酶，搅拌均匀，在一定温度条件下酶解一段时间后升温至95 ℃灭酶10 min。在4 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液待分析测定[14]。

1.3.2.2 牛肉酶解液水解度的测定

采用甲醛滴定法测定水解度[15-16]。吸取5 mL样品溶液稀释至100 mL，再吸取20 mL稀释液置于200 mL烧杯中，加60 mL去离子水，用标准NaOH（0.05mol/L）溶液滴定至pH 8.20，加入10 mL体积分数36%甲醛溶液，混匀后继续滴定至pH 9.20，记录加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积，重复3 次。

空白实验，除不加酶解液外，所有步骤同酶解实验。按公式（1）、（2）计算氨基酸态氮含量和水解度。

式中:V0为空白实验消耗的标准NaOH溶液体积/mL；V1为样品消耗的标准NaOH溶液体积/mL；C为标准NaOH溶液浓度/（mol/L）；m为测定用样品溶液相当于样品的质量/g；0.014为氮的毫摩尔质量/（g/mmol）；N0为样品总氮含量/（g/100 mL）；N1为酶解前游离氨基酸态氮含量/（g/100 mL）；N2为酶解后游离氨基酸态氮含量/（g/100 mL）。

1.3.3 美拉德反应析因试验设计

在前期试验基础下，发生美拉德反应的葡萄糖、甘氨酸、硫胺素分别设定一个高水平和一个低水平，以褐变程度和感官品质作为评定指标。析因试验是一种对所有因素的所有水平组合进行全面试验和分析的方法，其在试验因素较少、水平数较少的情况下能十分有效地得出最优试验方案[17]。本研究采用三因素二水平进行8 次试验，如表2所示，每组试验2 次重复，3 个平行。

1.3.3.1 美拉德反应产物褐变程度的测定

以20 g牛肉酶解液为底物，加入葡萄糖、甘氨酸、硫胺素，用NaOH溶液调节反应体系pH 7.5，常压条件下，放入恒温干燥箱中120 ℃条件下反应90 min。反应产物冷却至室温后稀释10 倍，在波长420 nm处测其吸光度[18]。

1.3.3.2 美拉德反应产物感官品质的评定

将反应后的每组样品稀释至同一体积分数，按顺序进行编号，采用10 分评分制。对各组样品的气味强度评分，由经过培训的10 名评价员对各样品评分，结果取平均值[19]。感官评分标准见表3。

1.3.4 美拉德反应液烧烤风味GC-MS测定

参考Matthias等[20]的方法，并稍作改动。固相微萃取:取3 g左右样品置于15 mL顶空瓶中，将老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分，于50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

气相色谱条件:采用DB-Wax色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气；气体流速为0.9 mL/min；进样口温度为250 ℃；柱箱采用程序升温:初始温度为40 ℃，然后以5 ℃/min升温至90 ℃，再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持7 min。

质谱检测条件:采用电子电离源正离子模式；电子能量70 eV；发射电流80 μA；检测器电压1 000 V。

1.4 数据分析

试验数据通过SPSS 19.0在显著性水平P=0.05条件下进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 牛肉总氮含量

根据国家标准的方法采用全自动凯氏定氮仪测得牛背最长肌（江苏黄牛）的总氮含量为（4.28±0.21） g N/100 g。

2.2 牛肉酶解条件的优化

由表4可以看出，根据极差分析各因素影响牛肉酶解液水解度的主次顺序为:E＞A＞D＞C＞B。由于试验结果要求较大的水解度，所以应挑选每个因素K值中最大值对应的水平组合作为牛肉酶解的最优工艺条件，由试验结果可知最优工艺条件组合为A2B4C3D3E4。但该组合在上述正交试验中并没有出现，故需进行验证实验。结果表明，A2B4C3D3E4条件下测得水解度为17.24%，高于正交试验中的最好结果15.15%，所以确定牛肉酶解液的最优工艺条件为:酶解温度50 ℃、酶解时间50 min、酶解pH值为6.5、m（风味蛋白酶）∶m（复合蛋白酶）=1∶1、加酶量质量分数8%。

从正交试验的结果中还可以发现5 个试验因素中加酶量对牛肉水解度的影响最大（R值最大），说明在实际生产中要着重考虑加酶量对牛肉酶解的影响。

2.3 美拉德反应产物析因试验结果

由美拉德反应模型体系试验结果（表5）可以看出，吸光度大小代表褐变程度的强弱，当葡萄糖、甘氨酸为高水平，硫胺素为低水平时，吸光度最大为0.263。当葡萄糖含量一定时，随着甘氨酸含量的增加，褐变程度及感官品质显著增加（P＜0.05），随着硫胺素含量的增加，褐变程度下降，感官品质增加，但均不显著（P＞0.05）；当甘氨酸和硫胺素含量一定时，随着葡萄糖含量的增加褐变程度及感官品质显著增加（P＜0.05）。

分别对试验结果进行方差分析，如表6、7所示，3 个因素葡萄糖、甘氨酸、硫胺素对褐变程度都有显著影响（P＜0.05）；葡萄糖与甘氨酸、甘氨酸与硫胺素之间存在交互作用且对褐变程度影响显著（P＜0.05）；葡萄糖、硫胺素之间，葡萄糖、甘氨酸、硫胺素三者之间不存在交互作用或交互作用不显著（P＞0.05）。将3 个因素按照对褐变程度影响的重要程度分类，由F值大小可知，甘氨酸是最主要因素，葡萄糖为主要因素，硫胺素为次要因素。同时，葡萄糖、甘氨酸的含量变化对感官品质的影响较为显著（P＜0.05），而硫胺素对其影响不显著（P＞0.05）；葡萄糖、甘氨酸之间存在交互作用且对感官品质影响显著（P＜0.05）；葡萄糖与硫胺素、甘氨酸与硫胺素之间，葡萄糖、甘氨酸、硫胺素三者之间在对反应液感官品质的影响不存在交互作用或交互作用不显著（P＞0.05）。将3 个因素按照对感官品质影响的重要程度分类，由F值大小可知，甘氨酸是最主要因素，葡萄糖为主要因素，硫胺素为非主要因素。

综上所述，甘氨酸是影响反应液褐变程度和感官品质最主要的因素，由试验结果可以看出高水平的甘氨酸能显著提高反应液的品质，即甘氨酸0.8 g；葡萄糖对反应液的褐变程度和感官品质也有着重要影响，高水平的葡萄糖对反应液的品质影响较大，故葡萄糖1.0 g；硫胺素对结果影响不大，从生产成本的角度考虑，低水平的硫胺素较好，即硫胺素0.3 g。所以通过析因试验确定3 个因素的最佳配比为葡萄糖1.0 g、甘氨酸0.8 g、硫胺素0.3 g。

2.4 挥发性风味物质气相色谱-质谱法分析

通过气相色谱-质谱法对最优配比条件下的美拉德反应液经顶空固相微萃取后的挥发性成分进行定性分析。根据计算机标准质谱图库检索、各组分的质谱图及数据分析，并通过峰面积归一化相对含量，结果如图1、表8所示。

挥发性成分中共检测出56 种化合物，主要是羧酸类（1.269%）、醛类（28.451%）、酮类（20.723%）、杂环类（45.342%，包括呋喃类、噻唑类、噻吩类等）、含硫化合物（33.666%）。从检测结果来看，反应液中含有较丰富的2-甲基-3-呋喃硫醇（6.008%），是肉香香气的主要原料，具有明显的肉香气味[21]，因此反应液肉香十分浓郁。检测出的风味物质中杂环类物质的相对含量最多（45.342%），噻吩及噻唑类化合物中的烷基或乙酰基取代物多具有坚果香、烤香、肉香，一些还具有水果的香气，对牛肉香气的形成起到非常重要的作用。这与早期Guy等[22]的研究是一致的。反应液中检测出2-甲基四氢噻吩-3-酮、双（2-甲基-3-呋喃基）二硫等烤牛肉的特征风味物质。此外，硫醇类物质作为烤肉类挥发性物质中主要的成分之一[23]，在反应液中也被检测到，且相对含量（13.193%）较为丰富。反应液通过气相色谱-质谱法检测出的多种化合物，尤其是烤牛肉的特征风味物质，使得反应液具有明显的烤牛肉风味，这与之前感官评定的结果是一致的。

3 结 论

在酶解温度50 ℃、酶解pH值为6.5、m（风味蛋白酶）∶m（复合蛋白酶）=1∶1、加酶量质量分数8%的条件下，反应50 min后可得水解度为17.24%的牛肉酶解液。常压条件下，20 g牛肉酶解液中添加葡萄糖1.0 g、甘氨酸0.8 g、硫胺素0.3 g，反应体系在pH值为7.5，120 ℃条件下反应90 min，反应体系产物吸光度为0.263，褐变程度较高，且肉香纯正，烤牛肉风味浓郁。气相色谱-质谱分析表明，美拉德反应模型体系反应液中含有多种烤牛肉特征挥发性风味物质如2-甲基-3-呋喃硫醇、2-甲基四氢噻吩-3-酮、双（2-甲基-3-呋喃基）二硫，与感官评定结果一致。

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Formation of Roast Beef Flavor in Model System at 120 ℃

LIU Senxuan, PENG Zengqi*, L☒ Huichao, LI Junke, WANG Fulong, CUI Baowei, LIU Shixin
(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, the enzymatic hydrolysis conditions of beef and the proportions of added sugar, amino acids and thiamine were optimized to build a Maillard reaction model system for generating roast beef flavor. By using orthogonal array design, the optimum enzymatic hydrolysis conditions were determined to be hydrolysis at 50 ℃ for 50 min with 8% of a mixture of flavourzyme (F) and protamex (P) at a mass ratio of 1:1 with an initial pH of 6.5. The optimal Maillard reaction system developed using a factorial design consisted of 20 g of beef hydrolysate, 1.0 g of glucose, 0.8 g of glycine, 0.3 g of thiamine, and the reaction was proceeded at 120 ℃ for 90 min with an initial pH of 7.5. The gas chromatographymass spectrometry (GC-MS) results demonstrated that the contents of 2-methyl-3-furanthiol, 2-methyl tetrahydrothiophen-3-ketone and 3,3’-disthiobis[2-methyl-furan] were relatively high, which featured the roast beef flavor. Overall, this model system was characterized by high degree of browning, the highest absorbance (0.263), inviting meat flavor and strong roast flavor as indicated by sensory evaluation.

enzymatic hydrolysis of beef; Maillard reaction; roast beef flavor; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS251.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510024

2014-09-26

国家现代农业产业技术体系建设专项(NYCYTX-38)

刘森轩(1989—),女,硕士研究生,研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail：lsenxuan@163.com

*通信作者：彭增起(1956—),男,教授,博士,研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail：zqpeng@njau.edu.cn