牡蛎蛋白活性肽的分离及生物活性研究进展

陈艳辉，李超柱，黎丹戎

（1．钦州学院，广西钦州535000；2．广西医科大学，广西南宁530021）

牡蛎蛋白活性肽的分离及生物活性研究进展

陈艳辉1，李超柱1，黎丹戎2

（1．钦州学院，广西钦州535000；2．广西医科大学，广西南宁530021）

牡蛎活性肽是海洋天然产物研究的重要组成部分，现代医学研究表明，牡蛎活性肽在抗肿瘤、抗氧化、降血压、降血糖等方面具有特殊的生理活性。就牡蛎蛋白质酶解法制备活性肽的分离纯化技术、牡蛎活性肽的生物活性作用等研究进展进行概述，为牡蛎活性肽的深入研究提供参考。

牡蛎；活性肽；酶解产物；分离纯化

浩瀚的海洋是人类保健和药品的天然宝库，迄今，人们已从各类海洋生物中分离获得14 500余种具有各种结构类型的海洋天然产物，近1/2具有各种生物活性；更重要的是超过0.1%的化合物结构新颖独特，活性显著，已成为先导化合物或新药来源［1］。海洋天然活性肽是海洋药物研究的重要组成部分，它们显示出多种多样的生理活性，如抗肿瘤活性、抗氧化性、抗高血压性、抗凝血、抗菌性、免疫活性、降血糖等［2-6］。但天然存在的海洋活性肽等在生物体中含量低，而且分离纯化困难，难以实现规模化生产［7］。为解决这一瓶颈问题，人们想到利用特异的蛋白酶水解，使其释放出具有活性的肽。由于酶法生产活性肽产品安全性极高，生产条件温和，水解易控制，可定位生产特定的肽，成本低，故已成为最主要的生产方法。该法还有一个突出的优点，就是可以将一些“惰性蛋白”转变为“活性肽”。牡蛎的蛋白质含量高，是采用酶解法制备生物活性肽的良好原料。现就牡蛎蛋白质酶解法制备活性肽及分离纯化技术、牡蛎活性肽作用方面的研究最新进展作一简述。

1酶解牡蛎蛋白质制备活性肽及分离纯化

牡蛎蛋白质酶解法制备活性肽及分离纯化工艺一般流程为：牡蛎→剥壳取肉→清洗→匀浆→酶解→灭酶→离心取上清液→酶解粗提物→分离纯化→活性肽。

1.1小于1 kDa肽的制备及分离纯化

于娅等［8］用碱性蛋白酶Alcalase18 U/kg于60℃、pH8.5下对脱脂牡蛎干粉进行恒温水解4 h，对酶解粗提物选择Sep hadex G-15凝胶柱，用醋酸-醋酸钠缓冲液进行洗脱，收集到5个组分，其中2、3、4组分具有很强的ACE（血管紧张转化酶）抑制活性的短肽，其相对分子质量在202～602之间，即大致为2肽～5肽的牡蛎短肽。

冯晓梅等［9］采用胰蛋白酶5%浓度于45℃、pH8.0对牡蛎蛋白质进行酶解4 h，使其释放出具备特殊活性的活性肽，粗提物上Sephadex G-25凝胶色谱柱，经NH4HCO3缓冲液洗脱，得到F1、F2、F3、F4 4个组分，取纯度和含量较多的组分F3和F4继续上DEAE2Sepharose FF离子交换色谱，用NaCl梯度洗脱，经过进一步分离纯化获得F31、F32、F41组分。TOF-MS测定结果显示样品纯度较高，同时测得F31、F32、F41的相对分子质量分别为885、810及409。

余杰等［10］采用复合酶2 614 U/g底物在温度45℃，底物质量浓度15.3 g/L条件下对牡蛎蛋白酶解3 h，取上清液，过Sephadex G-25柱，采用pH7.0，0.02 mol/L磷酸缓冲液进行分级分离，获得一种活性肽并命名为BPO，并根据BPO的洗脱体积和标准曲线求出其相对分子质量为751。

欧成坤［11］等采用537酸性蛋白酶酶解牡蛎蛋白质，通过高效液相色谱分析了水解度为16%的酶解产物的相对分子质量分布，具有特殊功能活性的肽对应相对分子质量为568和203，主要由2肽到5肽的多肽类物质。

1.2小于2 kDa肽的制备及分离纯化

汪秋宽等［12］采用木瓜蛋白酶于150 min、pH7.0、酶用量6%、温度45℃条件下对牡蛎肉进行酶解，将牡蛎酶解液离心，用相对分子质量截留量为30 000的膜组件进行超滤，超滤后用SephadexG-15凝胶柱分离，收集柱层析分离的洗脱液，洗脱液在280 nm下有两个吸收峰，其清除自由羟基、超氧自由基的作用很显著，估算其蛋白肽的相对分子质量分别为1 191和826左右。而采用中性蛋白酶在酶用量3%、温度65℃、时间110 min、pH6.0条件下对牡蛎肉进行酶解，酶解液处理与上述方法操作相同，结果洗脱液在280 nm下的2个吸收峰的蛋白肽组分的自由羟基清除活性最强，估算其相对分子质量分别为1 074和735左右。

周敏华［13］等采用胰酶（2.4×105U/g）水解近江牡蛎制备高F值寡肽，其方法是将牡蛎蛋白按底物质量分数16.4%、胰酶添加量15 000 U/g、pH 9.32、温度49℃酶解4 h，然后将酶解液用活性碳吸附，取上清液，用Biogel P2凝胶层析法，采用碳酸氢铵作为洗脱液洗脱，可得到F值大于20的寡肽混合物，其相对分子质量约1 450～800。

1.3小于5 kDa肽的制备及分离纯化

周先果［14］采用胰蛋白酶（1∶250）酶解牡蛎肉，其酶解条件为：加酶量2%，pH8.0，温度45℃酶解6 h，将酶解液上清用1%壳聚糖醋酸溶液进行絮凝法除杂质后，常温下再离心即得粗提物。将粗提物上SephadexG-25葡聚糖凝胶柱，用NH4HCO3缓冲液洗脱，结果层析图谱出现4个洗脱峰，经采用常规Tris-甘氨酸系统SDS-PAGE与小肽Tricine-SDS-PAGE电泳相结合的方法分析SephadexG-25层析柱各个层析峰的肽段分布情况可知，G-25Ⅳ峰：主要为小于2 512 Da的小肽等物质。

陈艳辉等［15］采用动物蛋白水解酶在60℃、酶的质量分数2.0‰、水解时间为4 h的条件下水解牡蛎蛋白质，酶解液经灭酶和脱色后，经柱层析、超滤膜分离（采用MWCO3000超滤膜）获得分子量小于3 000 Da的具有较好抗癌活性的牡蛎活性肽。

张辉［16］采用胰蛋白酶（1∶250）酶解牡蛎肉，在加酶量为2%、pH8.0、45℃条件下酶解6 h后，4℃离心30 min，上清液即得牡蛎酶解液。酶解液经过Sephadex G-50柱层析后得到两个峰，收集第Ⅱ峰，由凝胶层析结果可粗略估算出牡蛎酶解活性肽G-50Ⅱ峰的相对分子质量小于5 kDa。

2牡蛎活性肽的生物活性作用的研究

2.1抗肿瘤作用

2.1.1诱导分化肿瘤细胞

细胞形态与超微结构是细胞行使细胞功能的基础和表现，其改变在一定程度上可反映细胞相关功能活动状态的变化。因此，诱导分化处理前后肿瘤细胞形态与超微结构特征的改变是判断肿瘤细胞是否逆转分化的一个重要指标［17-19］。

梁盈等［20］为了研究牡蛎低分子活性肽BPO-L对人肺腺癌A 549细胞形态和超微结构的影响，分别采用光学显微镜和透射电镜观察了经0.1 mg/mLBPO-L处理后的A 549细胞，结果表明，BPO-L能有效的改变肺癌细胞的恶性形态和超微结构特征，使之出现与正常细胞相似的形态和结构变化，由此说明牡蛎活性肽BPO-L对人肺腺癌细胞具有诱导分化作用。

李祺福等［21］以HMBA处理组为平行对照，流式细胞仪检测细胞周期变化及以免疫细胞化学方法检测相关癌基因、抑癌基因表达变化，研究牡蛎低分子活性多肽组分BPO-L对人肺腺癌A549细胞分化的生物学效应，探索其对肺癌细胞的作用机理。实验结果显示，BPO-L能有效抑制A549细胞增殖活动，促使细胞阻滞于G0/G1期。在此过程中，A549细胞myc，MTp53等癌基因蛋白表达减弱，p21WAF1/CIP1和Rb等抑癌基因蛋白表达活性的增强。证实BPO-L对肺癌细胞具有显著的诱导分化作用。

黄大川［22］应用从僧帽牡蛎中分离提取的牡蛎低分子活性肽BPO-L处理人肺腺癌A549细胞，观察鉴定牡蛎低分子活性肽对人肺腺癌细胞的生物学效应及其作用性质，并进一步探索牡蛎低分子活性肽对人肺腺癌细胞的作用机制。结果表明，BPO-L能有效抑制人肺腺癌A549细胞增殖、分裂活动，细胞周期明显阻滞G0/G1期。光镜、透射电镜结果显示，经BPO-L处理后的A549细胞趋于扁平铺展状态，细胞体积增大，核质比例减小，核形状较为规则，核内异染色质减少，常染色质增多，高尔基体较为典型发达，粗糙型内质网增多，多聚核糖体减少，分泌颗粒增多。

2.1.2诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖

肿瘤是一种细胞增殖与死亡障碍性疾病，凋亡调控机制失常在恶性肿瘤的演进过程中发挥重要作用，故肿瘤治疗的关键是抑制肿瘤细胞的增殖或促进肿瘤细胞的凋亡。

余杰等［10］检测牡蛎活性肽BPO诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用机制。结果表明，BPO诱导HeLa细胞凋亡的效应主要通过对细胞周期阻滞和激活细胞凋亡信号通路来实现；BPO的作用机制与诱导凋亡基因Caspase3 mRNA表达上调和细胞周期（G0/G1期）阻滞有关。

周先果［14］观察牡蛎活性肽BPO G50-Ⅱ在不同浓度、不同作用时间对人舌鳞癌细胞株（Tca8l13）体外增值的抑制作用；应用倒置相差显微镜、H.E染色和透射电镜观察细胞形态学的改变；AO-EB荧光法观察细胞凋亡。结果表明，牡蛎活性肽BPO G50-Ⅱ对人舌鳞癌细胞株（Tca8113）体外增殖具有抑制作用，并能诱导其发生凋亡。廖共山［23等也探讨牡蛎活性肽BPO G50-II对人舌鳞癌Tea8113细胞增殖和凋亡的影响，结果与周先果相同。

李鹏［24］等为研究牡蛎活性肽组分BPO-1对人胃腺癌BGC-823细胞周期与基因表达的调控，结果显示，牡蛎天然活性肽BPO-1对肿瘤细胞的生物学效应主要是通过凋亡的诱导而表现为对细胞增殖的抑制作用。李夏［25］对牡蛎胰蛋白酶抑制剂的制备及其抗肿瘤活性的研究也表明，牡蛎胰蛋白酶抑制剂对人肺腺癌A549细胞生长有明显的抑制作用。

2.1.3增强机体免疫功能

免疫活性肽不仅能增强机体的免疫力，在动物体内起着重要免疫调节作用，而且还能刺激机体淋巴细胞的增殖，增强免疫器官的免疫应答能力及巨噬细胞的吞噬能力，提高机体对外界病源物质的抵抗能力，从而降低肿瘤的发生率［26］。李超柱等［27］以小鼠脾淋巴细胞为实验模型，通过淋巴细胞增殖实验和混合淋巴细胞实验，从细胞、分子水平研究牡蛎活性肽（利用动物蛋白水解酶水解牡蛎肉所得的分子质量小于3 kDa的肽）对小鼠脾淋巴细胞的免疫抑制活性及作用机制。结果表明，牡蛎活性肽可以抑制小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2和TNF-γ，由此推测牡蛎活性肽可能是通过抑制细胞因子的分泌来产生免疫抑制作用。提示牡蛎活性肽可提高人体的细胞免疫功能而防止肿瘤的发生。

2.2抗氧化作用

自由基参与许多生理和病理过程，是机体正常代谢的中间产物。人体内自由基含量随年龄增长而积累，过多的自由基会导致DNA的氧化破坏、蛋白质交联和肽键断裂、酶和激素失活、发生脂质过氧化反应，形成脂褐素（老年斑），沉积于心、脑、肾等器官使其功能减弱，机体免疫能力下降。自由基清除剂作为抗氧化物能不同程度地清除人体内积累的自由基。

周先果［14］为了探讨牡蛎酶解液的抗氧化活性，用普鲁士蓝反应法测定牡蛎酶解液还原能力，在DPPH体系、Fenton体系和邻苯三酚自氧化体系中分别检测牡蛎酶解液清除二苯代苦味酞自由基、羟基自由基和超氧阴离子的能力，并考察牡蛎酶解液在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUEA）过氧化体系中的抗氧化作用。结果表明，牡蛎酶解液清除羟基自由基的效果较强，是硫脲的3.5倍；牡蛎酶解液也具有较强的清除二苯代苦味酞自由基的能力；在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化体系中有明显的抑制作用。

汪秋宽等［28］分别检测了牡蛎木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解液体外自由羟基清除活性和体内抗氧化活性。结果表明，当分子量为1 191 Da和826 Da左右的木瓜蛋白酶酶解活性肽组分体外清除羟自由基活性分别达到53.6%和66.5%；当分子量分别为1 074 Da和735 Da左右的中性蛋白酶酶解活性肽组分体外羟自由基清除活性分别57.6%和70.5%。对小鼠肝脏GSH-PX酶、SOD活力、GSH含量显著提高，肝脏MDA含量显著降低。欧成坤［11］等研究结果显示，采用537酸性蛋白酶酶解牡蛎蛋白质，在水解度为16%的酶解产物中的肽对应相对分子质量为568和203肽，对二苯代苦味酞自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除的能力。

2.3降血压作用

降血压肽是通过抑制人体中血管紧张素转换酶ACE的活性而达到降血压作用。ACE是肾Ⅰ血管紧张素系统中对调节血压起重要作用的酶，它通过去除血管紧张素Ⅰ的碳末端His-Leu生成有血管收缩活性的血管紧张素Ⅱ，同时使舒缓激肽失活，引起血压升高［29-30］。故评价牡蛎活性肽的降血压作用主要看ACE抑制的效果。

张辉［16］用碱性蛋白酶所得牡蛎酶解液经葡聚糖凝胶柱层析的产物，测定对ACE的抑制作用。结果表明，Sephadex G-25Ⅲ组分对ACE抑制率达到60.44%。

于娅等［8］通过HPLC法定量马尿酸测定碱性蛋白酶酶解牡蛎蛋白的各组分短肽的ACE抑制活性。结果表明，牡蛎水解液为2肽到5肽的牡蛎短肽具有很强的ACE抑制活性。欧成坤［11］等研究结果显示，采用537酸性蛋白酶酶解牡蛎蛋白质，在水解度为16%的酶解产物中的肽对应相对分子质量为568和203肽，对ACE的抑制率为71.71%。

2.4降血糖作用

血糖升高是糖尿病的一个重要特征，测定各种条件下血糖含量是了解动物病情发展程度和药物作用的重要手段。张辉［31］采用腹腔注射四氧嘧啶造糖尿病模型小鼠，牡蛎活性肽低、中、高剂量组按0.5、1、2 g/kg灌胃，研究了牡蛎活性肽BPO不同剂量对其的降血糖作用效果。结果显示，牡蛎活性肽能显著降低四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的高血糖，其降血糖效果呈一定的剂量效应关系，一定范围内剂量增加则降糖效果增加。

3展望

从牡蛎中制取纯度高、活性好、安全性强的生物活性肽药物成分具有十分良好的发展前景。我国对牡蛎的应用开发己开展了很多研究工作，并有商业产品面市，但与国外发达国家相比存在较大的差距。由于目前研究中的牡蛎蛋白质酶解产物一般是各种肽段的混合物，活性效果也往往是多种肽段活性协作的结果。故今后对牡蛎蛋白质酶解法制备活性肽及分离纯化技术应不断改进，同时要设法提高多肽类物质的分析鉴定效率。相信随着科技的快速发展，一些先进的仪器和手段被应用后，国内在牡蛎活性肽的研究方面必将会取得突飞猛进的发展。

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The Progress on Biological Activity and Separation of the Bioactive Peptides of Oyster Protein

CHEN Yan-hui1，LI Chao-zhu1，LI Dan-rong2
（1.Qinzhou College，Qinzhou 535000，Guangxi，China；2.Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China）

Oyster active peptides are an important part of research on the natural marine product.Modern medical studies showed that oyster bioactive peptides have special physiological activity，such as anti-tumor，anti-oxidation，lowering blood pressure，blood sugar and so on.The enzymatic preparation and purification technology of bioactive peptides from oyster proteins，the biological activity of oyster active peptides were summarized，which will provide a reference for further study of oyster bioactive peptides.

oyster；bioactive peptide；hydrolysates；isolationandpurifieation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.033

2014-06-11

广西自然科学基金资助项目（2014GXNSFAA118066）；广西教育厅科研立项项目（2013LX162）

陈艳辉（1958—），女（汉），教授，本科，研究方向：天然产物有机化学。