乳和乳制品中嗜冷菌及其耐热酶的危害与控制研究

王娇，张筠，*，刘术明，刘文丽

（1.黑龙江东方学院，黑龙江哈尔滨150086；2.黑龙江贝因美乳业有限公司黑龙江安达151400）

乳和乳制品中嗜冷菌及其耐热酶的危害与控制研究

王娇1，张筠1，*，刘术明2，刘文丽2

（1.黑龙江东方学院，黑龙江哈尔滨150086；2.黑龙江贝因美乳业有限公司黑龙江安达151400）

嗜冷菌是乳低温贮藏中的主要腐败菌，嗜冷菌及其代谢酶的存在直接影响原料乳的质量，阐述了嗜冷菌及其耐热酶类对乳及乳制品的危害，并通过分析嗜冷菌的适冷机理和影响酶活的因素，探讨控制嗜冷菌及其代谢酶的方法，以保障原料乳质量。

嗜冷菌；耐热酶；危害；控制方法

嗜冷菌（Psychrotrophic bacteria）是指在6.5℃条件下，需氧培养10 d，在MPC琼脂平板上形成可计数菌落的细菌、酵母和霉菌，嗜冷菌包含有假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属，黄杆菌属和克雷伯氏菌属等［1］，由于生产规模的不断扩大，原料奶需要在工厂贮存的时间随之变长，低温贮藏时嗜冷菌大量生长繁殖，因为大多数嗜冷菌经巴氏杀菌即可被杀死而往往被忽略，近年来，人们逐渐发现嗜冷菌在低温条件下分泌的胞外蛋白酶、脂肪酶即使经高温处理仍能保留一部分活性，在低温贮藏时酶的活性逐渐被激活，它能分解乳制品中的脂肪和蛋白质，导致产品凝结、分层、产生苦味等不良品质。

1　嗜冷菌及其耐热酶对乳及乳制品的危害

1.1对原料乳的危害

低温贮藏时，原料乳中的嗜冷菌大量生长繁殖，嗜冷菌的繁殖过程中会代谢产生脂肪酶和蛋白酶，这些酶会导致乳中脂肪和蛋白质的分解。张甦［2］研究证明在4℃下贮存44 h～48 h时嗜冷菌数量最多并发生明显质变，如乳清析出、蛋白凝结和不良气味的产生，此外，王辉［3］、任静［4］、岳喜庆［5］等分析了酶活力与嗜冷菌数之间的关系，认为菌数与酶活力呈正相关，并证明菌体生长进入稳定期后，酶活即稳步增长，原料乳的质量也随之下降。

1.2对乳制品的危害

关于嗜冷菌代谢产生酶对乳制品质量的影响目前研究较多集中在其对UHT乳质量方面，Patricia Munsch-Alatossava［6］等研究证明，嗜冷菌代谢产生的脂肪酶会分解UHT乳中的脂肪球膜释放游离脂肪酸，导致脂肪上浮，pH值逐渐下降，蛋白酶能分解乳蛋白导致产品发苦并引起黏度的变化而形成胶凝，口感风味变差，货架期变短，张书文［7］、赵泽民［8］等研究证明，嗜冷菌产生的酶可导致UHT乳色泽的改变以及焦糖化反应加剧。姚春燕［9］提出嗜冷菌可导致干酪产量下降且呈现软而粘稠的组织结构，表面出现斑点、产生腐烂及腐败气味等，用接种了嗜冷菌的原料乳制作酸奶，结果酸奶的风味很差。此外，奶粉的结块、发苦等不良品质也被认为与嗜冷菌有关。

2　嗜冷菌产生的酶

2.1蛋白酶

嗜冷菌产生的蛋白酶可分为三类：胞内蛋白酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶，菌体被杀死后，胞内蛋白酶释放到乳中影响产品的品质，早在1984年，Kough［10］等就证明UHT奶发生胶凝与嗜冷菌产生的胞内蛋白酶有关，但目前研究较多的是胞外蛋白酶，主要是假单胞菌属产生的耐热的碱性金属蛋白酶，Zn2+和Ca2+构成酶活中心，分子量40 kD～50 kD，一般出现在对数生长末期，最适温度和pH分别为30℃～40℃和6～8，它能优先水解к-酪蛋白，使其失去对酪蛋白胶束的稳定作用，从而导致产品凝乳、分层等。

国外对嗜冷菌产生的蛋白酶的耐热性研究较早，1981年，Griffiths［11］等就通过研究13株假单胞菌产生的蛋白酶的热稳定性后得知这些蛋白酶经77℃，15 s的热处理仍然可保留55%～65%的活性，140℃加热5 s后仍能保留20%～40%的活性，而Adams［12］的研究也表明荧光假单胞菌MC60产生的蛋白酶在149℃的耐热能力是嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的4 000倍，均证明该蛋白酶对热有极高的稳定性。

2.2脂肪酶

部分嗜冷菌产生的脂肪酶极其耐热，残留的脂肪酶能分解脂肪释放的游离脂肪，这些游离脂肪在脂肪球的相互碰撞中起到粘合剂的作用，从而产生脂肪球簇而上浮，导致乳质量的变化［13］，假单胞菌产生的脂肪酶最适pH 8～9，多数在常乳中具有相当大的活性，最适反应温度为30℃～50℃，但有些在1℃～8℃，甚至更低的-10℃～-30℃也能引起乳制品腐败变质，因此控制脂肪酶的产生至关重要。

2.3半乳糖苷酶

除蛋白酶和脂肪酶外，嗜冷菌还能产生部分半乳糖苷酶，半乳糖苷酶能水解含半乳糖苷键的物质，如乳糖等，引起乳品质的变化。半乳糖苷酶与蛋白酶和脂肪酶一样，含有其他嗜温酶类不具有的氨基酸残基，可提高酶的耐热性。

3　控制嗜冷菌及其酶活性的方法

3.1酶耐热和嗜冷菌的适冷机理

目前，对嗜冷菌代谢产生的酶的耐热原因的研究相对较少，楠丁呼思勤［14］等在总结中外研究的基础上认为这些酶的耐热特性可能与其特殊的化学结构如氨基酸组成、蛋白质结构、氢键、共价键等有关，但其精确的耐高温机理还不清楚。嗜冷菌的适冷代谢机理方面，李晶等［15］认为，嗜冷菌之所以能保持在低温环境下的生长代谢，与其特殊的细胞结构有关，可支持其在在低温下吸收营养物质、正常产酶并保持酶的高活性。

3.2嗜冷菌及其代谢酶活的测定

3.2.1嗜冷菌的检测

目前对于嗜冷菌计数的方法较多，传统方法采用IDF推荐的PMC琼脂平板在6.5℃培养10 d之后计数，这种方法相对准确，成本较低，但培养时间长，不利于工厂的实际应用，IDF同时提出了嗜冷菌的快速检测方法：21℃培养25 h，但其结果只是估计值，不够准确，且该方法并未进行特异性筛选，21℃中存在嗜温菌生长的可能性，使检测结果不稳定；Maurilio［16］对apr基因设计简并引物，并利用PCR技术扩增假单胞菌属的apr基因，可以检测105cfu/mL的复原脱脂乳中的扩增产物，关晶岩［17］在此基础上确立了DNA提取的最佳方法并建立了两种基于PCR和荧光定量技术的原料乳中嗜冷菌计数的方法：16SrRNA-PCR计数法和apr-PCR计数法；Solimar Gonçalves Machado［18］等提出用PCR技术来检测原料乳中嗜冷菌，Danilo Ercolini［19］等采用随机扩增多态性DNA-PCR技术对原料乳中的嗜冷菌进行分子鉴定，李琳等［20］在研究各种快速检测方法的基础上分别分析了直接外荧光过滤（DEFT）、流式细胞计数（FCM）、实时PCR检测（RTPCR）、荧光原位杂交探针（FISH）、瞬时温度梯度凝胶电泳（TTGE）、ATP生物发光等技术的优缺点，为实际应用提供参考。

除了直接对嗜冷菌进行检测，Uelinton Manoel Pinto［21］等通过检测革兰氏阴性嗜冷菌中高丝氨酸内酯的量来间接反应嗜冷菌的量。

3.2.2嗜冷菌代谢酶活性的检测

根据酶活力的定义，可通过测定底物的减少量或产物的增加量来测定酶的活力，一般测定嗜冷菌蛋白酶的方法有福林-酚、琼脂扩散、茚三酮、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）等。近两年又开始运用RP-HPLC和荧光胺方法，但这些方法在使用上都存在局限性，王辉［22］等提出了用Azocasein法测定嗜冷菌耐热胞外蛋白酶活性的方法，并得出波长345 nm，酶与底物反应时间2 h，TCA质量分数12%，TCA终止反应后溶液静置时间30 min为最佳反应条件，该方法检出限好，操作简单，是检测乳中嗜冷菌代谢蛋白酶活性的理想方法。脂肪酶活性的测定方法较多，针对乳中嗜冷菌代谢产生的脂肪酶的测定，王欢等［23］比较了罗丹明平板法、橄榄油乳化法、对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活和对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活4种常用的脂肪酶活力测定方法，认为对硝基苯酚法重现性好，适用于脂肪酶活力的定量检测。

3.3控制措施

有研究证明［7］，4℃下储存的原料奶，如果初始嗜冷菌数小于5×104cfu/mL，则储存4 d后，嗜冷菌数小于1×105cfu/mL，若大于5×104cfu/mL，则4 d后嗜冷菌数大于5×105cfu/mL，由此可见，低温的抑制效果取决于原奶中嗜冷菌的初始含量，所以，控制原奶中嗜冷菌的数量显得尤为重要，牧场的环境卫生是控制乳中嗜冷菌数量的关键环节，牧场牛舍空气，草屑，牛粪等均藏有大量的嗜冷菌［24］，因此挤奶前对牧场环境和牛体卫生的处理非常必要；而相同的原料奶在2℃储存比在4℃储存生产出的UHT乳保质期更长，可采用深度冷藏的方法减少嗜冷菌及其代谢产物的产生；郭奇慧等［25］通过实验证明UHT乳中纤维蛋白酶活力、蛋白沉淀量、下层蛋白粒径、游离氨基氮含量随贮存时间的延长而增加，同时，4℃下嗜冷菌的平均代时一般为8 h～9 h［9］，缩贮存时间也是控制嗜冷菌产生酶的有效方法。

刘美凤［26］研究了加压CO2对荧光假单胞菌的杀菌效果，证明加压CO2可以延长细菌的延迟期，姚春艳［9］研究了CO2对延长农家干酪保质期的作用，证明其对假单胞菌属、肠杆菌属和乳酸菌均有一定的抑制作用，岳喜庆，李鹏［27］研究了乳酸链球菌素和EDTA对原料乳保鲜的作用，认为其能延长原料乳的保藏时间，王蕊等［28］、刘芳等［29］、喻东威等［30］分别研究了超声波、壳寡糖对原料乳保鲜的作用，认为它们均能在一定程度上抑制原料乳中嗜冷菌的生长，Mahmoud Sitohy［31］等研究证明在4℃下水牛乳中加入0.5%酯化大豆蛋白能显著抑制嗜冷菌的生长、产酸能力和蛋白分解能力，添加酯化大豆蛋白后酪蛋白的分解时间由2 d延长为10 d。Patricia Munsch-Alatossava［6，32］等等研究了N2对原料乳中嗜冷菌及其代谢酶的抑制作用，证明在6、7、12℃均能有效抑制乳中嗜冷菌的生长，延长乳的保藏时间。

酶活性方面，温度和pH是影响酶活的关键因素，多数嗜冷菌代谢产生的蛋白酶的最适温度和pH为30℃～40℃和6～8，脂肪酶的最适温度和pH分别为30℃～50℃和8～9。其中pH对其影响更大，适当调节可以部分抑制酶活性，但不能使之完全失活，对企业来说，最有效的方法还是从源头控制嗜冷菌的数量，并减少其代谢酶的产生。

4　结论与讨论

嗜冷菌代谢产生的酶对乳及乳制品的品质有很大的影响，目前的研究多集中在对嗜冷菌及其代谢酶的检测方面，对嗜冷菌的控制也多为理论研究，如添加抑菌物质等，较少能应用于实际生产，对乳品企业来说，做好源头控制，减少嗜冷菌的带入是最直接的控制措施，同时做好深度冷藏，减少贮藏时间，以减少耐热酶的产生，对乳制品的品质至关重要。

研究证明嗜冷菌代谢产生的蛋白酶和脂肪酶对乳及乳制品的品质有较大的影响，因此，所以加强对蛋白酶和脂肪酶特性的研究比单纯研究嗜冷菌本身更有意义。

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Hazard Analysis and Control of Psychrotrophic Bacterias and Heat Resistant Enzymes in Raw Milk and Dairy Products

WANG Jiao1，ZHANG Yun1，*，LIU Shu-ming2，LIU Wen-li2
（1.East university of Heilongjiang，Haerbin 150086，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Beingmate Dairy Co.，Ltd.，Anda 151400，Heilongjiang，China）

Psychrotrophic bacteria is the primary putrefying bacteria in low-temperature storage raw milk，Psychrotrophic bacteria and the thermostable enzymes they made have enormous implications on raw milk，in this article，the perniciousness Psychrotrophic bacteria and the thermostable enzymes they made to milk and dairy products are introduced，by analyze the mechanism how Psychrotrophic bacteria can live in low temperature and the factors that influence the enzymes'activities，investigate the methods to control Psychrotrophic bacteria and the enzymes they produce to guarantee the quality of raw milk.

Psychrotrophic bacteria；thermostable enzymes；perniciousness；control methods

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.038

2014-03-04

王娇（1987—），女（汉），硕士研究生，研究方向：乳品质量安全。