体外培养山羊毛囊生长的影响因素研究进展

于会国　崔志峰　雷静　张忠（山东科技职业学院山东潍坊261053）刘锋　王慧　曾勇庆（山东农业大学动物科技学院山东泰安）

体外培养山羊毛囊生长的影响因素研究进展

于会国崔志峰雷静张忠（山东科技职业学院山东潍坊261053）刘锋王慧曾勇庆（山东农业大学动物科技学院山东泰安）

毛囊是控制毛发周期生长的皮肤附属器官。研究毛囊相关生长因子、激素及药物等的作用机理和作用环节，对于成功构建毛囊体外培养模型至关重要。毛囊是一个由多层细胞组成的特殊器官，具有独特的结构和周期性再生的能力。毛囊产生毛，具有保存体温、保护体表的作用，是哺乳动物极其重要的皮肤附属器官。自1990年，Phlpott等[1]人首次利用成功的培养了人头皮游离毛囊以来，现已陆续成功培养了小鼠触须与体毛、大鼠体毛、绵羊毛囊、山羊毛囊、以及其它哺乳动物的毛囊。在山羊毛囊研究方面，尽管许多学者进行了大量的工作，但调节山羊毛囊生长、分化的因子以及毛囊主要细胞间的相互作用机制目前还不甚清楚。近年来研究发现，多种生长因子、激素、药物以及毛囊各细胞间的相互作用等，均可对动物毛囊生长发育产生抑制性或促进性影响。本文就影响体外培养山羊毛囊的一些生长因子、激素、药物的研究进展做一介绍。

1　生长因子

1.1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)（1）碱性成纤维细胞生长因子最早是从牛垂体中提纯得到的一种由146个氨基酸组成的蛋白质。此后，人们陆续在生殖系统、神经系统、腺体、骨骼、肿瘤细胞等多种体内组织器官发现bFGF的存在。bFGF与一个或几个高亲和力的受体作用，便可对上述组织器官的生长、形态发生、创伤愈合等方面产生调控作用。Peus D等人[2]的研究表明：bFGF是重要的促有丝分裂因子，也是毛发形态发生和毛囊分化的诱导因子。它不仅刺激毛乳头细胞、真皮鞘细胞等的增殖，同样也可以促进其分化。（2）利用毛囊体外培养模型研究bFGF对毛囊生长的影响被认为是一条方便且重复性好的途径。动物实验结果显示[3]，将bFGF添加进培养基中，光镜下观察可见培养的第1、2天游离毛囊显著生长，其生长速度与bFGF低剂量组和常规培养基组比较差异显著。同时毛乳头细胞和真皮鞘细胞合成DNA的能力也明显增强，且bFGF刺激毛发生长和毛囊相关细胞DNA合成的能力可被bFGF抗体所中和。说明一定浓度的bFGF对毛囊生长确有促进作用。Hideyo等[4]的研究同样显示，bFGF在生长期毛囊表达，进入退行期和休止期后表达消失，提示该因子参与和支持毛囊的生长。利用原位杂交技术可检测到生长期体外培养毛囊的毛乳头细胞、周围毛球部细胞以及外根鞘细胞中均有bFGF受体(bFGFR)RNA的表达，但在毛囊退行期和静止期则不能检测到上述RNA的存在[5]。说明碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在维持毛囊生长期中起重要作用。（3）bFGF对体外培养的角朊细胞和黑素细胞也有促分裂作用。bFGF受体在处于对数生长期的上述细胞中均有表达，说明该因子通过自分泌和旁分泌机制对体外培养的角朊细胞和毛囊黑素细胞的增殖起调节作用[6]。

1.2转化生长因子-ß(TGF-ß)（1）转化生长因子-ß(TGF-ß)是一类调节细胞增殖与分化的转化生长因子，在动物体内主要由淋巴细胞、内皮细胞和单核细胞产生，广泛存在于动物正常组织细胞和转化细胞中，能够调节细胞的死亡或凋亡、细胞外基质形成、动物个体的生长发育、损伤修复机体免疫和肿瘤形成等多种生理及病理过程，因此具有极其广泛的生物学活性。1978年，Piek E等学者[7]最早发现了TGF-ß。哺乳动物的TGF-ß包括3个亚型，即TGF-ß1、TGF-ß2、TGF-ß3。均以无活性形式合成与分泌。（2）研究发现，TGF-ß三个亚型对大多数细胞均有抑制其增殖的作用。所以，TGF-ß1可通过抑制毛囊相关细胞增殖并促进其凋亡从而控制毛囊由生长期向退行期转变。Foitzik等[8]向体外培养的小鼠毛囊添加TGF-ß1，结果显示游离毛囊的毛球中只有少量的增殖细胞而大量的细胞已凋亡，导致毛囊提前进入退行期。Inui等[9]向体外培养的毛乳头细胞中转染雄激素受体的真核表达质粒，再与毛囊角质形成细胞共培养，观察发现雄激素能够上调共培养的毛乳头细胞合成与分泌TGF-ß1，后者显著抑制了毛囊角质形成细胞的增殖。TGF-ß1抗体能够中和TGF-ß1对共培养的毛囊角质形成细胞的生长抑制作用。综上所述，TGF-ß1可能参与了雄激素源性脱发的发生。（3）TGF-ß2、TGF-ß3均可通过诱导细胞凋亡促进毛囊由生长期向退行期转变。体内研究表明，TGF-ß2多在毛囊末端上皮部合成与分泌，而TGF-ß3mRNA表达于毛囊外根鞘细胞[8,10,11]。Soma等学者[12,13]研究发现处于退行期体外培养毛囊的末端上皮组织和外根鞘部位分别合成TGF-ß2与TGF-ß3，而向处于生长期的游离毛囊添加TGF-ß2、TGF-ß3则可以抑制毛囊毛干的延长，诱导毛囊发生退行期样的形态学改变。用TGF-ß的中和抗体可以对抗上述因子对毛囊生长的抑制作用。

总之，多方面实验结果均已证实TGF-ß是毛囊生长发育过程中不可缺少的信号，并在毛囊生长周期中起着重要的调控作用。TGF-ß一方面可通过抑制毛囊细胞增殖和促进毛囊细胞凋亡调节毛囊的形态学发生发育以及毛囊的周期性循环；另一方面又可介导其他因素和因子对毛囊生长发育的产生影响。鉴于TGF-ß超家族成员具有复杂的功能与多样的信号传导通路。因此，对于TGF-ß如何调节毛囊生长发育的确切机制仍不清楚，是未来研究的重点问题。

1.3肝细胞生长因子(HGF)（1）肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种具有促进细胞有丝分裂作用的多肽类生长因子，是由Michalopoulors等于1983年首次从血浆和血小板中分离得到并证实的。近年来研究发现，HGF是由728个氨基酸组成的异二聚体双链结构，其中含有一个分子量为69KD的a链和一个分子量为34KD的ß链，且该生长因子在毛囊生长发育以及间充质-上皮相互作用过程中起着主要调节作用。（2）Linder等学者[14]发现HGF存在于毛囊真皮乳头细胞中，在毛囊形态发生时期及毛囊循环性生长周期中均有分泌，但以毛囊形态发生初期与毛发生长期HGF的表达量最高，该实验结果表明HGF可能影响毛囊的周期性生长。最近许多研究结果发现，毛发的周期性生长依赖于真皮毛乳头细胞分泌的一系列生长因子和分泌的其它可溶性信号的相互作用来调控，其中一个必要的生长因子就是HGF。Fujie等[15]发现将体外培养的毛囊外根鞘细胞和真皮毛乳头细胞混合培养于条件培养液中，外根鞘细胞向真皮毛乳头细胞移动非常显著，提示真皮毛乳头细胞能分泌一种旁分泌因子，吸引毛囊外根鞘细胞。而当研究者向培养液中加入由真皮毛乳头细胞分泌的HGF时，毛囊外根鞘细胞向毛乳头细胞的移动趋势显著增加。但是其它一些生长因子则无法引起外根鞘细胞的这种趋化作用。因此上述实验首次证实了HGF不仅对毛囊生长发育有促进作用，而且对上皮组织来源的外根鞘细胞有趋化作用。（3）随着对于HGF调控毛囊生长发育作用研究的不断深入，发现HGF还可能参与了毛囊周期性循环的调控过程。Jindo等对处于毛囊生长初期的小鼠背部皮下注射HGF，同时对对照组小鼠皮下注射0.1%的BSA-PBS。连续注射7d后，于第10天处死两组小鼠，就可以观察到靠近注射HGF部位的皮肤颜色仍然是黑的，这表明该处毛囊仍然处于生长初期，并且通过组织学观察还可发现，该部位的皮肤厚度增加以及毛囊组织增多；而在注射HGF处外的其它部位皮肤及注射0.1%BSA-PBS的小鼠皮肤颜色是灰色，提示此处的毛囊处于生长末期和退行期。这表明HGF可以延迟毛囊由生长期向退行期的转变，同时也能够促进表皮增厚、诱导毛囊组织分化。

2　激素

2.1雄性激素及其受体（1）雄激素(androgen)对毛囊的调控作用是通过细胞内的雄激素受体(androgen，AR)所介导的。雄激素主要是睾酮和双氢睾酮，而雄激素受体是一种配体依赖性转录因子。在动物体内血液循环中的睾酮在5-a还原酶作用下转变成结构更简单、作用更强的二氢睾酮。二氢睾酮与AR结合，经过一系列受体后机制进入细胞核内，配体-受体复合物和DNA上的配体结合域相结合，激活激素应答原件，进而调控基因表达和蛋白质合成[16]。（2）Pelletier G等学者研究发现，雄激素受体(AR)在大多数表皮角质形成细胞、部分皮肤成纤维细胞及皮脂腺的基底细胞和腺细胞都有表达，且这些受体都是高亲和力、高特异性的。但在毛囊相关细胞中，AR只在毛乳头细胞中表达，由此表明毛乳头细胞(DPC)是雄激素作用的靶细胞[17]。体外共培养DPC与ORSC实验表明，当向培养体系中加入生理浓度的雄激素时，可刺激DPC分泌类胰岛素生长因子-I(IGF-I)，促进外根鞘细胞的增值。体外培养小鼠毛囊实验也证明游离毛囊中DPC依赖雄激素产生IGF-I等可溶性生长因子，促进ORSC的增殖，从而刺激毛发生长，延缓毛囊进入退行期，对毛发生长期的维持起重要作用[18]。此外，雄激素在促进毛囊再生方面同样起到主要作用。Jahoda等[19]将培养的DPC移植到切去下半部分的毛囊中，结果在生理浓度的雄激素刺激下，移植的DPC重新形成毛乳头，从而诱导ORSC增殖产生新的能够生成毛干的毛球部，毛囊也重新进入了生长期。该结果提示毛囊的发育与再生依赖毛囊上皮细胞与毛乳头细胞间的相互作用，而雄激素在上述作用过程中发挥主要功能。

2.2雌性激素及其受体（1）长期以来，随着对性激素及其受体研究的不断深入，人们逐渐了解到不仅雄激素对毛囊生长起调控作用，雌激素也会对毛囊生长及毛发周期产生显著影响。雌激素(Estrogen)与雌激素受体(Estrogen recepter，ER)结合，改变毛乳头细胞的雄激素代谢水平，阻止睾酮转化为双氢睾酮，影响雄激素对毛乳头细胞的调控水平。目前，已经发现的雌激素受体有两种，即ER-a和ER-ß。它们是由不同的基因编码的两种蛋白质，具有高度同源性。（2）对离体的人和动物毛囊体外培养研究结果表明，外根鞘细胞和毛乳头细胞内均存在雌激素受体(ER)。Kondo等[20]发现雌激素对试管内培养的人头皮毛囊有生长抑制作用，加入生理浓度的雌激素后，毛干直径缩小，毛发断裂，生长期毛囊呈现退行期改变。其他学者经研究也指出，在离体的鼠皮肤给予雌激素处理后显著加速毛囊向退行期发展，当加入ER拮抗剂大多数毛囊由结束休止期并向生长期转变及促进毛发生长，以上表明雌激素可以直接诱导毛囊退行期的开始。然而雌激素对毛囊的这种作用是通过抑制毛囊内的5-a还原酶还是间接诱导睾酮转化为效应较弱的雄激素以及雌激素对于毛乳头细胞的具体作用机制还未完全明了。有研究表明，体外培养的毛乳头细胞增殖过程中，雌激素含量比相应皮肤成纤维细胞中显著增高[21]。培养的毛乳头细胞同时表达的mRNA。但这2种受体的存在部位有差异。ER-ß主要存在于胞核，而ER-a在胞质中和胞核中均存在，且ER-a在胞核中的表达水平是在胞质中的2倍[22]。上述提示ER-a与ER-ß的存在于比例在雌激素信号传导通路中起到十分重要的作用。

3　药物

3.1米诺地尔米诺地尔是1967年由美国UpJohn公司研制的一种心血管系统药物，可直接松弛血管平滑肌，舒张小动脉，降低外周阻力，从而降低血压。临床应用发现，80%的患者出现多毛，于是将其局部外用治疗脱发。其治疗脱发的作用机制可能与促进毛囊区血流量增加，延长毛囊生长期，缩短休止期，促进细胞增殖，开放钾离子通道等因素有关[23]。Han等[24]发现，米诺地尔可活化人毛乳头细胞的细胞外信号，调节蛋白激酶和蛋白激酶B，增加Bcl-2/Bax比率，从而减少细胞凋亡，延长毛乳头细胞的存活时间，促进毛乳头细胞增殖，延长毛囊生长期，最终使体外培养的人毛囊显著增长。Michelet等发现，米诺地尔及其代谢产物除发挥其通常的药理作用外，还可激活生长期及退行期毛囊毛乳头细胞内前列腺素合成酶-1，使细胞凋亡减少，延长毛囊生长时间。Sato等在秃发者头皮取出的毛乳头细胞中加入米诺地尔进行培养后，细胞内17ß-羟基类固醇脱氢酶和5a-还原酶活性增加。Lachgar等发现，米诺地尔在毛发周期中可显著增加毛乳头细胞内血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA和蛋白合成，说明米诺地尔在毛囊生长保持血管活性方面有重要的生理学作用。

3.2环孢菌素A 该药物是从真菌的代谢产物中分离提纯，作为强效免疫抑制剂应用于临床。范卫新等将环孢菌素A用于小鼠毛囊体外培养模型，发现小鼠毛囊的DNA合成率增加，证实环孢菌素A可能通过影响毛囊内VEGF、肝细胞生长因子、神经生长因子及卵泡抑素表达发挥作用，刺激毛囊细胞增殖，抑制细胞凋亡，从而刺激小鼠触须毛囊生长。Gafter-Gvili等[25]也证实，环孢菌素A可抑制小鼠诱导分化的p21和p27基因表达，使白细胞介素-1a表达增加，转化生长因子-ß表达下降，Bcl-2/Bax比率增加，p53基因和白介素-1ß转换酶表达活性下降，最终导致毛囊休止期延迟，促进毛囊生长；并发现环孢菌素A可增加毛囊数量，抑制毛囊角化细胞凋亡，从而延缓毛囊衰亡，诱导毛囊生长。

3.3他克莫司(FK506)FK506是真菌的代谢产物，其结构与大环内酯类抗生素相似，是T细胞活化抑制剂。Rodriguez等对难控性秃发患者应用FK506后，发现其可促进毛发迅速重建。Tsuji等[26]研究发现，局部应用FK506可刺激毛囊生长，推迟毛囊从生长期向退行期转变，延长毛囊生长时间。

3.4骨化三醇骨化三醇为维生素D3经人体肝脏和肾脏代谢后的活性产物，作为钙调节剂和癌细胞增殖抑制剂应用于临床，对多数正常细胞和恶性肿瘤细胞有抗增殖作用，还可降低血清碱性磷酸酯酶和血清甲状旁腺素水平。Sauer等证实，骨化三醇通过调节细胞内Bcl-2/Bax比率，减少真皮成纤维细胞和皮肤角化细胞凋亡。Vegesna等[27]发现，骨化三醇可作用于角化细胞启动毛囊周期，增加透明质酸7、8(Ha7、Ha8)、Hb3角蛋白表达，促使正常毛囊形成，刺激毛发生长。Paus等证实，局部应用骨化三醇可促进化疗导致毛发脱失后的毛囊重建。

3.5维甲酸(RA)RA是一组与维生素A结 构类似的化合物，其可抑制多种致癌物的致癌过程和诱癌作用，抑制白血病细胞增殖，诱导白血病细胞分化成熟；影响骨的生长和上皮代谢，具有调节表皮细胞有丝分裂和表皮细胞更新，促进正常上皮细胞增生分化、角质溶解等作用。在体内，RA能显著刺激皮肤毛囊增生，提高细胞内受体连接蛋白和维甲酸X受体-a水平，延长毛囊生长期。Everts等[28]发现，RA促进毛囊生长时期关键酶视网膜脱氢酶(Aldh1a1、2、3)的表达时间和位置不同，Aldh1a2主要表达于各个周期中的毛囊外根鞘、基底层、棘层，以及生长期和退行早期的毛乳头；Aldh1a3主要在毛囊生长期的中后期表达于真皮乳头、前皮质和毛干。但RA对体外培养的毛囊没有明显增生作用，Foitzik等认为，RA可促使体外培养的人毛囊提前进入退行期，影响毛干延长。

3.6螺内酯螺内酯作为醛固酮的竞争性抑制剂，在体内吸收后经过肝脏代谢成其活性产物坎利酮，可竞争性抑制雄激素与毛囊的雄激素受体结合，降低细胞色素P450依赖酶17ß-羟化酶和裂解酶水平，抑制雄激素合成中多种酶的活性，降低17a-羟化酶活性，减少睾酮产生[29]，使血中睾酮和二氢睾酮浓度下降，从而降低雄激素对毛囊的作用，起到治疗雄激素脱发的目的。另外，螺内酯作为抗雄激素类药物，临床多用于治疗女性多毛症。因此，螺内酯对毛囊生长的作用呈双向性，其对体外培养的毛囊生长影响机制仍未阐明。

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（2015–06–26）