抑制白细胞介素-17活性短肽疫苗对ApoE-/-小鼠免疫功能的影响

抑制白细胞介素-17活性短肽疫苗对ApoE-/-小鼠免疫功能的影响

王顺

(湖北省武汉市第一医院, 湖北 武汉, 430022)

关键词:抑制IL-17活性短肽疫苗; ApoE-/-小鼠; 安全剂量; 免疫功能

白细胞介素17(IL-17)是近年来发现的又一新的细胞因子[1]，它主要由活化的T淋巴细胞产生, 能诱导多种基质细胞产生多种前炎性细胞因子和造血活性因子, 如白细胞介素-6(IL- 6),白细胞介素-8(IL-8), 粒细胞集落刺激因子(GCSF),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1), 前列腺素E2(PGE2)等[2-3]。IL-17可通过促进炎症反应造成组织损害，如在关节炎、多发性硬化症(MS)/EAE、银屑病、肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)等多种自身免疫性疾病[4-5]中发挥关键作用。IL-17 亦参与调节粒细胞生成(通过诱导G-CSF表达)[6-9]及宿主防御反应。有研究[10-11]表明，冠心病患者和AS小鼠体内存在Th17细胞功能亢进。本课题组前期用4个IL-17的肽段偶联后获得疫苗免疫新西兰兔，筛选出能产生高滴度抗体且该抗体对IL-17活性抑制率高的肽段(0002)。本实验通过ApoE-/-小鼠实验研究该疫苗的安全有效使用剂量及对ApoE-/-小鼠免疫功能的影响，现报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物和试剂

SPF级ApoE-/-小鼠，购自Jackson试验室(Bar Harbor, Maine, 美国)，由北京大学实验动物中心繁殖。50 mmol/L Na2CO3(pH 9.6), 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)或10 mmol/L PBS(pH 7.2), 0.02%～0.05% Tween-20的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液(pH 7.4)。

1.2IL-17活性的短肽疫苗制备

通过文献阅读分析出IL-17的功能位点，用DNAStar分析IL-17的氨基酸序列的亲水性、抗原性及二级结构的特点，设计4条肽段，并通过前期实验筛选出了能产生高滴度抗体且该抗体对IL-17活性抑制率高的肽段。

1.3IL-17活性的短肽疫苗小鼠毒性试验

选取8周龄健康雄性ApoE-/-小鼠分为12组，每组5只，分别以5、10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200 μg/只的剂量行腹腔注射IL-17活性的短肽疫苗。观察1周内动物健康状态、有无异常反应、中毒症状及死亡情况。

1.4IL-17活性的短肽疫苗对小鼠血清特异性抗体的影响

选取8周龄健康雄性ApoE-/-小鼠20只，分为试验组和对照组。试验组注射IL-17活性的短肽疫苗，剂量0.1 mL; 对照组注射生理盐水，剂量0.1 mL。于0、2、4、6周共免疫4次，并分别对ApoE-/-小鼠进行剪尾取血，分离血清于-80 ℃保存备用。小鼠血清中特异性抗体效价测定：利用间接ELISA方法测定小鼠血滴中特异性抗体的效价。以IL-17作为捕获抗原溶于包被液(0.5 mg/mL, pH 9.6碳酸盐缓冲液)中，并在ELISA板上每孔加人100 μL, 于4 ℃保存过夜。次日用洗涤缓冲液PBS-Tween 20洗涤3次，甩干。将封闭液以每孔200 μL的量加入，于37 ℃封闭90 min同样用PBS-Tween 20洗涤3次。将各待检血清稀释200倍，每孔中加入100 μL, 同时以未免疫的小鼠血清为阴性对照，以前期实验分离纯化的抗IL-17抗体为阳性对照。于37 ℃孵育90 min后，按上述同样方法洗涤3次。每个孔中加100 μL二抗, 37 ℃孵育90 min后，再次洗板3次。随后每孔加入100 μL的TMB, 37 ℃下显色30 min, 最后加入50 μL(2 mol/L)的H2SO4终止反应。并于405 nm下测定其OD值，当(OD待检样品-OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)≥2时判定为阳性。以阳性对照样品进行ELISA测定的效价建立OD值与ELISA滴定效价的函数关系来计算抗体效价。

2结果

2.1IL-17活性的短肽疫苗体内毒性试验及安全剂量

在给ApoE-/-小鼠注射了IL-17疫苗时发现，剂量为5、10、15、20、25 μg/只时，ApoE-/-小鼠无任何异常症状，为安全剂量；当剂量为30、40、50、60、80 μg/只时，ApoE-/-小鼠开始出现精神萎靡、行动迟缓等不良症状，但没有死亡；当剂量为100、200 μg/只时, ApoE-/-小鼠出现了明显的不良症状，开始死亡。

2.2IL-17疫苗对ApoE-/-小鼠血清特异性抗体效价的影响

IL-17疫苗免疫后，ApoE-/-小鼠血清中特异性抗体效价(1og2)发生变化。在免疫2周时，试验组和对照组免疫后的平均效价都无显著变化(P>0.05)。在免疫后的第6周，试验组抗体效价平均为10.3, 显著高于同期对照组(P<0.05), 说明IL-17疫苗在ApoE-/-小鼠休内能到达免疫效果。

3讨论

动脉粥样硬化(AS)是一种严重危害人类健康的疾病，与其相关的冠心病是全世界范围的重要死因。近年来研究表明，动脉粥样硬化是一种与免疫有关的慢性炎症反应性疾病，由效应性T细胞功能异常介导的免疫炎症反应，在动脉粥样硬化的形成和斑块的破裂中发挥了重要的促进作用，斑块内炎症细胞及其炎症产物对粥样斑块脂质中心的扩大、纤维组织完整性的破坏及细胞外基质的不断降解均有重要作用。冠状动脉壁的炎症反应参与了动脉粥样硬化和血栓的形成过程，在血管的收缩、舒张、痉挛和血栓形成等过程中发挥极其重要的作用，但触发炎症反应的原因尚未明确。IL-17是近年来备受关注的一种细胞因子，它主要由活化的T淋巴细胞产生, 能诱导多种基质细胞产生多种前炎性细胞因子和造血活性因子, 如IL- 6、IL- 8、GCSF、TNF、IL- 1、PGE2等，同时IL-l7可促进细胞分泌多种细胞因子，并与TNF-α及IL-1等细胞因子有着复杂的联系[12], 在多种疾病的发生和发展中处于关键地位。IL-17和其特异性受体同样在动脉粥样硬化中发挥着重要作用，IL-17可通过激活巨噬细胞分泌单核细胞趋化蛋白，使单核细胞聚集并进入血管内皮下，同时还促进巨噬细胞表面LDL受体的合成及巨噬细胞对LDL的摄取，促进粥样斑块形成。IL-17还可调节黏附分子和Thl细胞，促进TNF-α的表达，进而促进炎症反应。在动脉粥样硬化发生过程中，血管内皮的损伤可引起TNF-α的大量释放，而TNF-α又可促进IL-17的释放，二者通过协同作用造成血管内皮下免疫复合物沉积，进而形成血栓。IL-17还通过与TNF-α的协同作用，作用于微环境导致冠状动脉粥样硬化，从而促进冠心病的进展。IL-17尚可通过MAP激酶途径和NF-kB-DNA途径介导全身的炎症反应。目前研究[13]认为, IL-17通过血管壁上IL-17受体上调产生动脉粥样硬化损害并引起系统炎症，IL-17水平升高还可通过激活巨噬细胞系统引起动脉损害进一步加重。有研究结果显示，有动脉粥样硬斑块形成的ApeE(-/-)小鼠动脉血管壁的IL-17水平与对照组比较有明显升高, Th17细胞增加的比例与斑块的大小成正相关，并且发现可以用中和性抗IL-17Ab阻止其斑块的发展。将抗中和性抗IL-17 Ab输入小鼠体内，实验结束时发现小鼠动脉斑块面积、最大狭窄、平均狭窄程度均较对照组有明显下降；斑块较稳定，纤维帽增厚，胶原及平滑细胞增加。研究者在体外用IL-17刺激平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞及DC，发现其炎性反应加重。同时有研究[14]表明, IL-l7抗体、IL-17R、IgG1Fc融合蛋白、IL-17特异性可溶性受体或特异性抑制剂及IL-17R的单抗可不同程度地阻断IL-17的部分效应。已有研究[15]表明，用IL-17抗体中和IL-17后, RA经典动物模型—胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠早期关节炎症减轻或消失，晚期CIA小鼠的骨损伤能够有一定程度的恢复。因此, IL-l7疫苗在IL-17相关疾病治疗中展示出了良好的前景。

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收稿日期:2014-11-18

中图分类号:R 392

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)03-126-02

DOI:10.7619/jcmp.201503041