胶质瘤组织中miR-200b与CD133的表达变化及意义

刘爱群，余青云，彭忠兴，黄叶青，刁胜朋，程静，王文涛，洪铭范(广东药学院附属第一医院临床医学院，广州510008)

胶质瘤组织中miR-200b与CD133的表达变化及意义

刘爱群，余青云，彭忠兴，黄叶青，刁胜朋，程静，王文涛，洪铭范
(广东药学院附属第一医院临床医学院，广州510008)

摘要:目的观察胶质瘤组织中miR-200b和CD(133)的表达变化，并探讨其意义。方法将80例胶质瘤患者作为试验组、另选择20例接受开颅手术的脑外伤或脑出血患者为对照组。采用原位杂交和免疫组化技术检测试验组胶质瘤组织及对照组正常大脑组织中的miR-200b与CD(133)，分析胶质瘤组织中miR-200b与CD(133)的相关性及其与患者临床病理参数的关系。结果试验组miR-200b阳性表达率(32.65%，32/80)与对照组(80.00%，16/20)比较，P=0.001。试验组CD(133)阳性表达率(67.50%，54/80)与对照组(15.00%，3/20)比较，P=0.000。试验组miR-200b与CD(133)的表达呈负相关(r=－0.09，P=0.006)。试验组miR-200b和CD(133)表达与患者病理分期有关(P均＜0.05)，与性别、年龄无关。结论胶质瘤组织中miR-200b低表达、CD(133)高表达，两者均与胶质瘤病理分期有关。

关键词:脑肿瘤;胶质瘤;微小RNA-200b;分化抗原簇蛋白133

微小RNA(miRNAs)是重要的调控因子，能调控细胞的增殖、分裂、分化、凋亡等过程。研究［1～4］表明，miR-200b在肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移过程中发挥重要作用，对多种肿瘤具有抑制作用。CD133是干细胞和肿瘤干细胞表面特异标志蛋白，在白血病和乳腺癌中表达上调［5，6］。研究［7］显示，miR-200b可通过靶向调控CD133的表达抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭以及干细胞的形成。本研究采用免疫组化和原位杂交技术，分析胶质瘤组织中miR-200b和CD133的表达变化，并探讨其意义。

1　资料与方法

1.1临床资料选择南华大学第一附属医院2010 年3月～2014年2月收治并确诊为胶质瘤的80例患者(试验组)，术前均未行放化疗，手术切除肿瘤组织。其中男44例、女36例，年龄7～62岁、中位年龄42岁;根据WHO肿瘤分类标准，Ⅰ级15例、Ⅱ级27例、Ⅲ级30例、Ⅳ级8例。病理诊断结果均由2名以上病理科医生共同确诊。另将20例接受开颅手术的脑外伤或脑出血患者作为对照组，其脑组织经HE染色证实为非肿瘤组织。两组一般资料具有可比性。

1.2主要试剂原位杂交检测试剂盒与ElivisionTMPlus二步法免疫组化试剂盒均购自武汉博士德公司，DAB显色剂购自北京中杉金桥公司，地高辛标记的miR-200b探针序列购自美国Exiqon公司，CD133单克隆抗体购自CST公司。

1.3miR-200b与CD133检测及分析方法①原位杂交检测胶质瘤组织与正常大脑组织中的miR-200b。切片后脱蜡至水。3%胃蛋白酶消化20～30 min，水洗后4%甲醛固定。按miRNAs原位杂交说明，探针用无酶水稀释，稀释比例为1∶500，先用预杂交液于55℃预杂交2 h后再用地高辛标记的miR-200b探针于55℃进行杂交过夜。次日于不同浓度SSC缓冲液中彻底洗涤干净。室温封闭30 min。生物素化鼠抗地高辛室温孵育2 h。DAB显色并于镜下控制显色时间，苏木素复染细胞核，充分水洗，中性树胶封片保存。②免疫组化检测胶质瘤组织与正常大脑组织中的CD133。采用ElivisionTMPlus二步法，切片后脱蜡至水。按需要对切片进行高压修复，冷却至室温，PBS液洗净。每张切片加50 μL一抗体，室温下孵育4℃过夜，PBS洗净后每张切片加50 μL生物素标记的二抗体，室温下孵育10 min。PBS洗净，每张切片加50 μL链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min，PBS洗净后DAB溶液显色，镜下控制显色时间，苏木素复染细胞核，充分水洗，中性树胶封片保存。③免疫组化和原位杂交结果分析。miR-200b 与CD133呈棕黄色颗粒的阳性信号定位于胶质细胞与胶质瘤细胞的细胞质与细胞核中。综合阳性信号的染色强度和分布范围进行半定量，阳性强弱按以下标准判断［1］。每个标本于高倍光镜下观察5个具有代表性的视野，对阳性染色的细胞比例和染色程度进行统计。组织细胞阳性染色程度计分:阴性计1分;+ 计2分;++计3分;+++计4分;组织细胞阳性细胞分布比例计分:染色细胞小于10%计1分;染色细胞10%～50%计2分;染色细胞51%～75%计3分;染色细胞大于75%计4分。两种得分相乘，＜8为低表达，≥8为高表达。显微摄像后运用病理图像分析系统对光密度值进行检测，结果进行统计分析。

1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用t检验;计数资料比较用χ2检验，相关性分析用Spearman检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

试验组miR-200b阳性表达率(32.65%，32/80)与对照组(80.00%，16/20)比较，χ2=10.26，P=0.001。试验组CD133阳性表达率(67.50%，54/80)与对照组(15.00%，3/20)比较，χ2=17.99，P=0.000。试验组miR-200b与CD133的表达呈负相关(r=－0.09，P=0.006)。试验组miR-200b与CD133的表达与临床病理参数的关系见表1。miR-200b和CD133表达与与患者病理分期有关(P均＜0.05)，与性别、年龄无关。

3　讨论

miRNAs通过调控其靶基因影响一系列mRNAs的表达，从而在生理和病理学过程中发挥重要作用。越来越多的研究［8］表明，大量的miRNAs在肿瘤的发生与发展过程(细胞的增殖、干细胞自我更新以及分化)中发挥癌基因或抑癌基因作用。大量miRNAs的异常表达与胶质瘤发生发展有关，如miR-34a［9］、miR-203［10］、miR-22［11］在胶质瘤中表达下调; miR-372［12］、miR-17［13］、miR-221/222［14］在胶质瘤中表达上调，为胶质瘤患者不良预后的重要标志物。由此可见，具有癌基因或抑癌基因样作用的miRNAs可能与人类胶质瘤的发生密切相关。最近的研究发现，miRNAs的表达与多形性胶质瘤母细胞瘤(GBM)患者的总生存期和疾病进展的时间相关。Srinivasan等［15］分析了222例同时进行了放化疗再辅以TMZ治疗的GBM患者的10个miRNA，发现miR-20a、miR-106a和miR-17-5p在长期存活的患者中高表达，而miR-221/222、miR-148a、miR-31、miR-146b和miR-193a在短期存活的患者中高表达。一些miRNAs如miR-181c、miR-21、miR-221/222、miR-195、miR-146a与胶质瘤细胞放化疗抵抗相关，表明这些miRNAs具有预测特性。

miR-200家族成员包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，其中miR-200b-200a-429簇位于1p36染色体，而miR-200c-141簇位于12p13染色体［16］。在功能上，miR-200家庭成员可以调控一系列转录因子，包括Zeb1、Ets-1、Suz12［17］。在胶质瘤中，miR-200b通过靶向CREB1抑制胶质瘤细胞的增殖［18］。Tang等［1］研究显示，miR-200b在胃癌组织中表达下调，并且其表达状态与胃癌患者的临床分期、淋巴结转移以及预后生存相关。然而Cao等［19］显示，miR-200b在卵巢癌中表达上调，并且与患者的临床分期、组织分化程度以及预后生存相关。CD133是一种常见的肿瘤干细胞标志物，最初在造血干细胞中被发现。CD133在多种实体肿瘤中高表达，如乳腺癌［6］、结肠癌［20］、肺癌［21］，并可作为肿瘤患者预后的生物标志物。本研究结果表明，胶质瘤组织中miR-200b低表达、CD133高表达，miR-200b的阳性表达率随着胶质瘤恶性程度的增加而降低、CD133的阳性表达率随着胶质瘤恶性程度的增加而增高。可见，胶质瘤组织中miR-200b与CD133的表达与患者病情程度有关。

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(收稿日期:2015-01-29)

通信作者:洪铭范

基金项目:广东省医学科研基金立项课题(A2013321) ;省企业技术研发与升级改造专项基金项目(B2013B0218011251)。

文章编号:1002-266X(2015)19-0053-03

文献标志码:B

中图分类号:R739.41

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.019