1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物学鉴定

王静，韩丽，迟晓云，冯智慧(青岛思达中狮国际心肺血管医院，山东青岛6607;青岛市中心血站)

1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物学鉴定

王静1，韩丽2，迟晓云2，冯智慧2
(1青岛思达中狮国际心肺血管医院，山东青岛266071;2青岛市中心血站)

摘要:目的对1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物学进行鉴定，确定其ABO血型的等位基因型。方法1例ABO血型正反定型不符患者，对其血液样本进行血型血清学检测、ABO基因分型检测、ABO基因Exon6、7序列分析。结果该样本血清学结果正反定型结果不符，正定型抗A弱凝集，反定型检出不规则抗-A，血清学符合A亚型的表现。ABO基因分型检测的结果显示为O1/A。Exon6、7外显子及第6内含子序列单倍型测序与A101相比，其中一个等位基因为O102(261G/del、297A＞G、646T＞A、681G＞A、771C＞T、829G＞A) ;另外一个等位基因为A205(467C＞T、1009A＞G)，导致P156L、R337G。结论本例ABO血型基因Exon7的两个点突变导致了A氨基转移酶的活性降低，为A205亚型。

关键词:血型; A亚型;基因突变;基因测序

人类血型系统有35种，但ABO血型系统仍是最具临床意义的血型系统。目前，ABO变异型(亚型)的等位基因报道较多［1，2］。在ABO基因库中，ABO亚型基因已超过300余种，其中A亚型超过140种，中国人群的A亚型也陆续有报道［3，4］。本研究对1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物学进行鉴定，确定其ABO血型的等位基因型。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料患者女，26岁，因胸闷就诊于青岛市某心肺血管医院，医院检测ABO血型正反定型不符，2014年10月29日将患者一份血液样本(EDTANa2抗凝)送至青岛市中心血站中心血型参比实验室进行检测。该患者无输血史，无怀孕流产史，未患重大疾病或接受过手术，近期无感染史。

1.2试剂及主要仪器单克隆抗-A、单克隆抗-B、抗-AB、抗A1(Sanquin公司) ;试剂ABO红细胞、抗-H、A2细胞(上海生物制品有限公司) ;人源抗-A、抗-B(中国医学科学院输血研究所) ;抗-D试剂(Millipore公司) ;基因组DNA提取试剂盒(Invitrogen公司) ; ABO基因分型初筛试剂盒(ReadyGene公司) ; Ex-Taq试剂盒、LA-Taq试剂盒(TaKaRa公司)。所有试剂均在有效期内使用。

1.3血型血清学检测患者全血标本离心取50 μL压积红细胞三洗，试管法正反定型。怀疑A亚型后加做人源-A、人源-B、-A1、A2c和-H，应用筛选细胞和一组试剂谱细胞进行抗体筛选和抗体鉴定，明确或排除不规则抗体的存在。

1.4ABO基因分型检测提取标本基因组DNA，采用Invitrogen DNA提取试剂盒提取。DNA定量分析检测DNA浓度，纯度A260/A280比率在1.6～1.9。按照ReadyGene ABO血型基因检测试剂盒操作说明进行PCR扩增，扩增后产物通过2%琼脂糖凝胺电泳，以150 V电泳12 min凝胶紫外成像，并且分析ABO血型SSP基因分型结果。

1.5ABO基因Exon6、7序列分析引物设计参照Olsson等［5］的报道，对Exon6和Exon7进行双向扩增。PCR扩增反应程序如下: 95℃预变性10 min; 94℃、60 s，63℃、90 s，72℃、60 s，10个循环; 94℃、60 s，61℃、90 s，72℃、60 s，25个循环; 72℃延伸10 min，10℃保温。扩增产物切胶纯化，正反双向测序。在ABI3100-Avant上进行测序分析。对其PCR产物经割胶纯化后，克隆入T载体后将PCR产物转入大肠杆菌，挑选6～10个阳性克隆进行测序，确定样本的单倍型。序列分析采用Gentle软件进行分析。

2　结果

2.1血清学结果红细胞检测出弱A抗原，血清中存在弱抗A抗体，血清学表现为Ax型，不规则抗体检测阴性。正定型中标本-A+，人源-A++，与-A1、-B、人源-B无反应。反定型中A1c+，Bc+++，与A2c、Oc、自身c无反应。抗-H中Pc++++，Ac++，Oc++++。红细胞A抗原较弱，且不与-A1抗体反应，H抗原表现较强，与O型红细胞H抗原相当;血清反定型中有弱的-A1抗体(+)。

2.2基因分型结果标本基因初步分型结果为O1/A，见图1。

2.3ABO基因Exon6、7序列分析结果经过分析发现，Exon6杂合位点为261G/del、297A/G。Exon7 为467C/T、646A/T、681A/G、771C/T、829A/G、1009A/G。见图2。经过克隆测序，与参比序列A101比较确定标本的基因型为A205/O102(表1)。

3　讨论

目前已发现约341种ABO等位基因。ABO亚型的形成具有不同的分子机制，主要为碱基缺失、插入、替代、拼接点突变、等位基因杂交等。A型主要的两种亚型为A1和A2，两种亚型占A型的99.9%。A2是A亚型比较常见的一种亚型，约占A型的20%，其血清学的特点表现为正定-A与试剂单克隆-A反应呈弱凝集，与人源多克隆-A反应稍强，与试剂单克隆-A1不反应;反定血清中可检出抗A1抗体，与A2c不反应;在血型反定型的检测中1%～8%的A2个体和25%的A2B个体血清中产生同种抗A1抗体。有学者使用单克隆抗体的流式细胞检测，估计了A1与A2红细胞上抗原位点的数量分别是8×105～12×105与1×105～4×105。目前国际上报道的A2等位基因有A201～A221，共22种。A205等位基因是日本学者Ogasawara等首次报道，国内学者也发现多种A2亚型［6，7］，且中国人群中A2亚型的分子结构以A205占优势［8］，大多数A2等位基因先证者为亚洲人群［9，10］。上海血液中心数据显示中国人群中A201等位基因占A2亚型的20%［11］。有报道高加索人群中几乎所有A2亚型的遗传基因为A201。我们发现的A205亚型与Gen-Bank公布的基因序列一致，标本基因含467C＞T、1009A＞G两个突变。碱基的替换使得部分氨基酸也发生了变化，导致位156氨基酸由脯氨酸(Pro)变为亮氨酸(Leu)，337位氨基酸由精氨酸(Arg)转变为甘氨酸(Gly)。这两个氨基酸的改变决定了A2糖基转移酶的活性，使A2糖基转移酶的催化活性大为降低。此标本另外一条等位基因为O102等位基因，其与O101等位基因在Exon6第261位胞嘧啶缺失，造成了O基因在261位后发生阅读框的移动，形成终止密码子，提前终止了转移酶的翻译，使其编码出来的蛋白只有115个氨基酸，没有转移酶的催化功能区。

本实验室曾经对血清学结果极像Bx亚型的标本进行分子生物学检测(血型基因直接测序和单倍型测序)，最终定型为Bw03型。提示血清学亚型的结果并不可靠。目前已发现341种ABO等位基因，但是血清学表型却没有这么多，说明一种血清学表型对应数种ABO等位基因。鉴于目前我国对血清学亚型报告较多，且常常缺乏核碱基或氨基酸改变的实验数据，建议对血清学反应特殊标本例如抗原减弱或正反定型不符的标本，不要只根据血清学检测的经验报告为ABO亚型，应采用分子生物学方法进行鉴定。目前，核苷酸序列测定是发现新等位基因的惟一方法。另外，建议将血清学反应格局特殊的标本送能够进行分子生物学鉴定的血型参比实验室确认，避免误报。青岛市中心血站输血研究所是我省较早开展ABO亚型基因测序的实验室，具有一定经验。

目前国内对ABO亚型个体的输血原则尚缺乏明确的描述，由于A2亚型红细胞上A抗原数量较少，在血型鉴定时如果将无偿献血者A2亚型误判为O型输注给O型受血者，则会导致溶血性输血反应。在37℃有反应的抗-A抗体，应考虑其是否具有临床意义，在配血时应加以考虑。但基本遵循同型或相容性输注原则。对于本例A205亚型的个体作为受血者手术备血，不应输入A型血液制品，此例标本血浆中检出同种抗A1抗体，会与供者红细胞上的A1抗原发生免疫反应。从现有的血清学特性和分子机制来看，应输注O型洗涤红细胞，以确保输血安全。另一方面，由于A2抗原与A1抗原不仅存在量的差异还存在质的区别，使得A2抗原的抗原性较弱。因此临床医生将A2亚型器官捐献者的心脏、肾脏、肝脏等捐给B型或者O型的器官受体，可使受者器官的生存期明显延长［12，13］。

参考文献:

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(收稿日期:2015-03-17)

通信作者:冯智慧

基金项目:青岛市市南区科技发展资金项目(2013-13-013-YY)。

文章编号:1002-266X(2015)19-0051-03

文献标志码:B

中图分类号:R457.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.018