慢传输型便秘大鼠胃肠组织中PI3K/AKT/eNOS信号通路相关标志物的表达变化及意义

李旻昊，张国志，袁梅，李曙光，陈俊卯(河北联合大学附属医院，河北唐山063000;无锡市第五人民医院)

慢传输型便秘大鼠胃肠组织中PI3K/AKT/eNOS信号通路相关标志物的表达变化及意义

李旻昊1，张国志1，袁梅2，李曙光1，陈俊卯1
(1河北联合大学附属医院，河北唐山063000;2无锡市第五人民医院)

摘要:目的观察慢传输型便秘(STC)大鼠胃肠组织PI3K/AKT/eNOS信号通路相关标志物(p-Akt蛋白、NO 及eNOS)的表达变化，并探讨其意义。方法84只健康成年Wistar大鼠，随机分为对照1组、对照2组、模型1组、模型2组、模型3组及模型4组，各14只。模型1、2、3、4组每日予以苯乙哌啶(8 mg/kg)灌胃制作STC模型，对照1、2组予以等量生理盐水灌胃。模型3组及模型4组大鼠饲养第70天时，每天腹腔分别注射10 mg/mL的LY294002(100 mg/kg)和50 mg/mL的L-NAME(10 mg/kg)。对照1组60 d时、对照2组90 d时、模型1组60 d时、模型2组90 d时、模型3组90 d时及模型4组90 d时，采用Western blotting法检测各组大鼠胃窦、小肠和远端结肠组织p-Akt蛋白。对照1组60 d时、对照2组90 d时、模型1组60 d时、模型2组90 d时采用ELISA试剂盒法检测胃肠组织中NO和eNOS含量。结果模型1组远端结肠组织p-Akt蛋白表达较对照1组低，模型2组小肠、远端结肠组织p-Akt蛋白表达较对照2组低，模型3组远端结肠组织p-Akt蛋白表达较模型2组低，模型4组远端结肠组织p-Akt蛋白表达较模型2组高(P均＜0.05)。模型1组、模型2组大鼠胃窦、小肠、远端结肠组织NO和eNOS含量呈逐渐增高趋势(P均＜0.05)。结论STC大鼠胃窦组织p-Akt表达变化不明显，小肠组织p-Akt表达有减少趋势，远端结肠组织p-Akt表达明显降低，胃窦、小肠、远端结肠组织NO和eNOS含量增多且呈逐渐增高趋势。推测PI3K/AKT/eNOS信号通路参与了大鼠STC的发生，而且主要是通过影响远端结肠组织来完成。

关键词:慢传输型便秘;实验动物模型; p-Akt蛋白;一氧化氮;内皮型一氧化氮合酶

慢传输型便秘(STC)是一种以肠动力障碍为特征的临床疾病，主要表现为大便次数减少、便意缺乏、大便干燥、排出困难等症状。STC 发病率呈逐年上升趋势，该类患者常伴有腹胀，听诊肠鸣音明显减少，严重影响患者的生活质量。目前对STC病因及发病的具体信号机制尚缺乏足够的认识。磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)家族是生长因子超家族信号转导

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过程中的重要分子，可被多种细胞因子和理化因素激活。蛋白激酶Akt是位于PI3K下游的调节分子。研究发现，PI3K/Akt信号通路参与了细胞生长、增殖、分化、运动、存活和代谢等相关的信号转导［1］。NO作为一个重要的信使分子，与机体的炎症反应、氧化应激及细胞增殖等密切相关［2］。本研究观察了STC大鼠胃肠组织PI3K/AKT/eNOS信号通路相关标志物(p-Akt蛋白、NO及eNOS)的表达变化，并探讨其意义。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器苯乙哌啶(河南省常乐制药厂)，p-Akt抗体(美国Cell Signaling公司) ; PI3K阻断剂LY294002和eNOS抑制剂L-NAME(美国Sigma公司)，NO及eNOS试剂盒(上海锐聪实验室设备有限公司)，BL-410生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，银丝电极(自制，直经0.5 mm，长4 mm)。

1.2STC动物模型建立及胃肠组织获取84只健康成年Wistar大鼠，220～240 g，雌雄各半，由河北联合大学动物实验中心提供。随机分为对照1组、对照2组、模型1组、模型2组、模型3组及模型4组，各14只。模型1、2、3、4组每日予以苯乙哌啶(8 mg/kg)灌胃制作STC模型，对照1、2组予以等量生理盐水灌胃。模型3组及模型4组大鼠饲养第70天时，每天腹腔分别注射10 mg/mL的LY294002 (100 mg/kg)和50 mg/mL的L-NAME(10 mg/kg)。每5 d记录1次大鼠大便粒数、大便干重，采用活性炭灌胃法测定首粒黑便排出时间来评估肠道传输功能。60 d时，模型1、2、3、4组日均粪便粒数小于对照1、2组，日均每粒粪便质量大于对照1、2组，首粒黑便排出时间长于对照1、2组(P均＜0.05) ;且与对照1组相比，模型1组大鼠结肠慢波频率明显减慢，振幅增加，波形表现为不规则的近似正弦波样曲线。STC大鼠造模成功。对照1组60 d时、对照2 组90 d时、模型1组60 d时、模型2组90 d时、模型3组90 d时及模型4组90 d时采用戊巴比妥溶液0.22 g/100 g行腹腔内注射麻醉、固定。经上腹正中切口入腹，暴露腹腔，冷PBS冲洗，用眼科剪剪取胃窦、小肠和远端结肠组织，备测。

1.3p-Akt蛋白、NO及eNOS检测p-Akt蛋白检测采用Western blotting法。将各组大鼠的胃肠组织液氮研磨，转入离心管，加入冷PBS 2～3 mL，高速匀浆30 s，1 000 r/min离心2 min，重复2～3次，弃上清，沉淀中加入蛋白裂解液100～200 μL(用前加入PMSF，两者比例为100∶1，30 min内有效)，依组织量而定，冰上裂解10～20 min，4℃，15 000 r/min，离心15 min，取上清，分装至1 mL EP管中－70℃保存。采用BCA蛋白定量法，将各组蛋白分装标记完成，煮沸后保存于超低温冰箱中或进行电泳实验。电泳后的胶体经过转膜、封闭等步骤，孵上一抗，放在冰箱中的摇床上4℃过夜，8～12 h后取出，PBS冲洗3次，孵上二抗，常温下摇1～2 h后，暗室进行显色，得到显有所需条带的X线片，将定影后的X线片用Mixrotek Scan Wizard扫描软件进行电脑扫描，Image J图像分析软件做灰度分析。对照1 组60 d时、对照2组90 d时、模型1组60 d时、模型2组90 d时采用ELISA试剂盒法检测胃肠组织中NO和eNOS含量。

1.4统计学方法采用SigmaStat3.5统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

各组大鼠胃窦、小肠和远端结肠组织p-Akt蛋白、NO、eNOS水平比较见表1。对照1组、对照2组大鼠胃窦、小肠及远端结肠组织NO和eNOS含量差异变化不明显;模型1组、模型2组大鼠胃窦、小肠、远端结肠组织NO和eNOS含量呈逐渐增高的趋势(P均＜0.05)。

表1　各组大鼠胃窦、小肠和远端结肠组织p-Akt蛋白、NO、eNOS水平比较(±s)

注:与对照1组比较，*P＜0.05;与对照2组比较，#P＜0.05;与模型2组远端结肠组织比较，△P＜0.05。

组别　p-Akt蛋白　NO(μmol/g)　eNOS(U/mg)对照1组胃窦　35 520.90±457.82　105.75±2.47　4.08±1.80小肠　34 247.74±387.15　107.36±2.33　4.11±2.05远端结肠　36 420.90±367.83　107.43±2.38　4.07±1.96对照2组胃窦　36 148.30±398.34　108.35±1.96　4.09±1.74小肠　36 071.50±265.71　106.80±2.92　4.10±1.97远端结肠　34 665.80±368.32　105.16±2.45　4.09±1.63模型1组胃窦　35 542.33±398.76　144.85±2.29　4.96±2.89小肠　33 701.41±412.49　168.57±2.61　5.33±3.36远端结肠　28 142.33±413.29*212.74±2.56　5.90±3.32模型2组胃窦　35 534.69±479.41　140.09±2.54　4.76±2.57小肠　26 529.70±369.46#161.24±2.17　5.27±2.94远端结肠　26 534.69±383.46#204.47±2.83　5.65±3.07模型3组远端结肠　18 246.71±871.48△　　－　－模型4组远端结肠　33 218.71±531.70△　－　－

3　讨论

STC严重影响患者的生活质量［3］，目前临床治疗效果仍不理想［4，5］。因此找到其病因及发病具体机制，从根本上找到合理的治疗方案至关重要。本研究采用临床上常用的止泻剂复方苯乙哌啶经进行灌胃建立大鼠STC模型，该模型大鼠排便次数减少，肠道传输减慢，与便秘患者具有相同的临床症状和病理生理改变。

NO作为肠道神经系统中主要的抑制性神经递质，参与肠道动力调节、肠黏膜血流调节、分泌功能调节等，可作为抑制剂直接松弛肠道平滑肌，并可通过减弱肠道慢波起博使结肠环肌自发性钟摆式节律收缩减少，其在便秘发病机制中的作用受到了广泛关注［6～8］。NO是由L-精氨酸经NOS催化合成。NOS是NO合成的限速酶，其中eNOS是合成NO的主要限速酶。因NO很不稳定，而且在体内需通过NOS的作用才能生成，因此更多研究倾向于NOS。Shahid等［9］研究发现，黏膜下丛和肌间丛NOS免疫反应性均明显增高，从而证实NOS在STC发病中的作用，其机制可能是黏膜下丛和肌间丛内大量的NOS神经元释放NO，使结肠推进性收缩受到抑制。谭丽等［10］研究显示，NOS在STC组的表达增强，阳性细胞数目增多，NOS的异常表达诱导过量的NO生成，过多的NO会使结肠处于持续抑制状态，从而导致肠道蠕动减弱，参与了STC的发病过程。Sjolund等［11］对NO在STC患者结肠中的作用进行了研究，衡量在应用不同的自主神经阻断剂前后，离体肌条对电场刺激的反应，认为由NO所介导的非肾上腺非胆碱能抑制性神经的增加为引起STC患者的结肠动力紊乱的重要机制。但是关于其发生的具体信号机制仍然不是很清楚。本研究发现，STC大鼠胃窦组织p-Akt表达变化不明显，小肠组织p-Akt表达有减少趋势，远端结肠组织p-Akt表达明显降低，胃窦、小肠、远端结肠组织NO和eNOS含量增多且呈逐渐增高趋势。且在运用PI3K阻断剂LY294002 和NOS抑制剂L-NAME后，远端组织p-Akt的表达升高，所以我们推测PI3K/AKT/eNOS信号通路参与了大鼠STC的发生，而且主要是通过影响远端结肠组织来完成。

研究［12］发现，Cajal间质细胞在控制胃肠道运动中起重要作用，主要参与胃肠道慢波电活动，传导电活动，传递神经冲动。STC患者结肠中Cajal间质细胞密度显著减少，且细胞体积也缩小［13～16］。但是PI3K/AKT/eNOS信号通路是否是通过作用于Cajal间质细胞，从而影响结肠的慢波活动，导致STC的发生，还需进一步研究。

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·临床研究·

(收稿日期:2015-02-03) 2014-10-29)

通信作者:张国志

文章编号:1002-266X(2015) 19-0027-03

文献标志码:A

中图分类号:R574

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.009