气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型的建立

王健，魏丹，谢肄聪(天津医科大学，天津30005;天津医科大学总医院)

气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型的建立

王健1，魏丹1，谢肄聪2
(1天津医科大学，天津300052;2天津医科大学总医院)

摘要:目的采用大黄泻下法复合改良线栓法建立气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型。方法50只雄性SD大鼠，随机分为A组(10只)、B组(10只)、C组(15只)、D组(15只)，A组不做处理，B组、D组提前灌胃大黄7 d，C、D组之后接受大脑中动脉阻塞术，B组仅做颈正中切口后缝合。观察各组大鼠一般形态、血液流变学变化，流式细胞术检测外周血内皮祖细胞(EPCs)。结果D组大鼠被毛黯淡枯燥杂乱，爪甲颜色浅淡，双眼浅红、微睁、无神，精神萎靡，自主活动少，对外界刺激反应迟钝，体质量增长缓慢，舌质由淡红转为紫黯。与A、B、C组相比，D组血液流变学指标水平高，EPCs数量少(P均＜0.05)。结论采用大黄泻下法复合改良线栓法成功建立了气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型。

关键词:脑血管疾病;大脑中动脉栓塞;气虚血瘀证;血液流变学;内皮祖细胞

大鼠大脑中动脉线栓法诱导的大脑中动脉栓塞(MCAO)脑缺血模型［1］是研究局灶性脑缺血及缺血再灌注最常用的造模方法。目前，中医药治疗脑血管疾病的机制研究多采用和借鉴MCAO模型。然而在中医理论体系下，疾病的发生发展过程中病与证往往是同时存在的，所以简单复制疾病动物模型或证候动物模型并不能满足中医药研究对动物模型的需要。本研究采用大黄泻下法复合改良线栓法模拟脑缺血再灌注损伤，旨在采用中西医结合理论指导下的病证结合造模法，为临床中西医结合研究脑血管疾病的病理机制和机理奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验动物健康SPF级雄性SD大鼠50只，体质量220～260 g，购于北京大学医学部实验动物科学部，许可证号: SCXK(京) 2009-0017。

1.2主要试剂与仪器生大黄粉剂(深圳华润三九医药贸易有限公司，批号: 1008172S) ;大鼠淋巴细胞分离液(美国Sigma公司) ; PE标记兔抗鼠CD34(美国Santa Cruz Biotechnology) ; FITC标记兔抗鼠CD133(北京博奥森生物技术有限公司) ; 0.01 mol/L PBS缓冲液、0.5% BSA缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。普利生全自动自清洗血流变仪(北京普利生集团) ; LBY-N6B(德国Hereaus公司) ;流式细胞仪(FACSCalibur型，美国BD公司)。

1.3气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型的构建方法及评价所有大鼠平衡饲养3 d，随机分为A组(10只)、B组(10只)、C组(15只)、D组(15只)，A组不做处理，B组、D组提前灌胃100%生大黄溶液(80℃水冲泡大黄超微粉后再80℃水浴5 min，自然冷却后双层纱布过滤，浓缩至100%，4℃冰箱保存，用时水浴至室温［2］)，4 g/kg，灌胃7 d。C、D组之后根据参照文献［1］方法建立MCAO模型，模型成功判定标准参考文献［1］，评分为2～4分则视为脑缺血再灌注模型构建成功。B组仅做颈正中切口后缝合。参考扈新刚研究方法，观察大鼠外貌、精神、活动、舌质等判断其是否出现气虚血瘀证症状。术后24 h大鼠股静脉剪开取血，枸橼酸钠抗凝剂抗凝，检测各项血液流变学指标;并采用郭新宾等［3］密度梯度离心法分离提取外周血内皮祖细胞(EPCs)，流式细胞仪计数CD34/CD133双荧光标记阳性细胞。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

A组大鼠被毛光亮整齐，爪甲颜色如常，双目鲜红、有神，活动自如，活泼好动，对外界刺激反应灵敏; B组大鼠被毛黯淡且稍枯燥杂乱，爪甲颜色浅淡，双目浅红、有神，活动自如，自主活动减少，对外界刺激反应灵敏; C组大鼠被毛黯淡枯燥杂乱，爪甲颜色浅淡，双目浅红、无神，自主活动少，对外界刺激反应稍迟钝; D组大鼠被毛黯淡枯燥杂乱，爪甲颜色浅淡，双眼浅红、微睁、无神，精神萎靡，自主活动少，对外界刺激反应迟钝。B、C和D组大鼠体质量增长缓慢，甚至出现负增长。B组大鼠舌质淡红; C组大鼠造模后舌质由淡红转为紫色; D组大鼠在造模后舌质由淡红转为黯紫。各组最终均选取10只大鼠。各组大鼠血液流变学变化见表1、2。A、B、C、D组每20万单位的EPCs数量分别为51.904±4.270、53.523±3.541、42.000±16.610、35.827±4.347，C、D组与A、B组比较，D组与C组比较，P均＜0.05。

表1　各组大鼠血液黏度比较(mPa·s，±s)

注:与A组比较，*P＜0.05;与B组比较，▲P＜0.05;与C组比较，●P＜0.05。

组别　全血黏度(低切1/s)全血黏度(低切5/s)全血黏度(低切30/s)血浆黏度(高切200/s)全血高切还原黏度　全血高切相对指数A组　22.892±0.517　10.552±0.515　6.313±0.469　4.856±0.448　6.585±0.689　3.202±0.239 B组　23.432±0.713　10.263±0.527　6.014±0.341　4.328±0.381　6.371±0.382　3.127±0.216 C组　27.572±0.969＊▲　11.589±0.445＊▲　7.878±0.268＊▲　5.507±0.206＊▲　7.292±0.185＊▲　3.457±0.061＊▲D组　31.502±0.153＊▲●　13.609±0.315＊▲●　8.902±0.275＊▲●　6.263±0.847＊▲●　8.547±0.876＊▲●　3.983±0.034＊▲●

表2　各组大鼠血液红细胞聚集性能比较(±s)

注:与A组比较，*P＜0.05;与B组比较，▲P＜0.05;与C组比较，●P＜0.05。

组别　血沉(mm/h)　血沉方程k值　红细胞聚集指数(mPa·s)　红细胞刚性指数　红细胞压积(%) A组　2.364±1.531　22.388±3.754　4.103±0.362　4.342±0.386　40.01±0.632 B组　4.333±1.751　28.388±9.186　4.258±0.151　4.106±0.328　45.42±1.960 C组　6.836±0.659＊▲　35.152±5.273＊▲　4.738±0.315＊▲　5.103±0.251＊▲　50.67±1.03＊▲D组　7.010±1.265＊▲●　37.482±6.288＊▲●　4.891±0.185＊▲●　5.983±0.964＊▲●　52.31±3.276＊▲●

3　讨论

急性脑血管疾病可归为中医学的“中风”范畴。缺血性脑血管病中医临床分为肝阳暴亢、风痰阻络、痰热腑实、阴虚风动及气虚血瘀5类证型，其中又以气虚血瘀证所占比例最高［4］，因此本实验选择建立该证型脑缺血相关模型。多因素复合模型基于中医药理论，结合现代医学理论与实验动物科学知识，分别或同时采用中医学病因复制证候模型和现代医学病因复制疾病动物模型，使模型动物同时表现出疾病和证候的特征［5］。病证结合动物模型是指在传统中医理论的指导下，运用六淫、饮食、情志、劳倦等中医特有的致病因素建立中医病因证候模型，在此基础上通过药物或手术等方法，建立西医疾病的模型［6］，制造出既符合西医疾病的特点又具有相应的中医症候特征的复合型动物模型。病证结合动物模型更好地体现了疾病的特点，能够更好地了解疾病的发展规律，从而更好地为中医临床实践提供服务［7］。

本研究采用复合造模思路，选择经典的大鼠大脑中动脉线栓法建立MCAO脑缺血模型，大黄泻下法造成气虚血瘀证候，复合这两种方法建立气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型。该模型的评价指标由3方面组成:①根据参考文献的研究方法观察大鼠外貌、精神、活动、舌质等变化。研究［8］表明，气虚血瘀证大鼠会有精神萎靡，双眼浅红、微睁、无神，自主活动少，对外界刺激反应迟钝，被毛黯淡枯燥杂乱，爪甲颜色浅淡，舌质由淡红转为黯紫等证候。本研究中D组出现气虚血瘀证候，且比B组及C组严重。②在1986年第2届全国活血化瘀研究学术会议上，血液流变学指标变化正式被列为诊断血瘀证标准之一。有研究［9，10］报道，气虚血瘀证大鼠的全血黏度、血浆黏度、血沉、血沉方程k值、红细胞压积、红细胞聚集指数均显著增高。杨海燕等［11］研究发现，缺血性中风气虚血瘀型患者的全血黏度、全血还原黏度(低、高)、血浆黏度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原较健康人高。本实验D组血液流变学指标较A组及C组增大，该结果与其他研究一致。③EPCs参与受损血管内膜的再内皮化，在维持内皮稳态方面发挥重要作用［12］; EPCs还可用于预测脑卒中后神经功能损伤程度、预后及脑血管疾病的治疗［13～15］;可作为判定脑损伤的标准之一。本实验气虚血瘀证大鼠模型EPCs数量比正常大鼠少。且D组大鼠外周血EPCs数量较A组及C组减少，说明大鼠脑损伤程度严重。

本研究在使大鼠形成气虚血瘀证的基础上，再进行缺血再灌注处理，以达到中医病证结合动物模型的要求，使模型鼠的发病过程更接近临床的病理过程。这不仅保证了模型病、证的准确性，同时较单纯中医证型造模方法的造模时间短，可靠性及稳定性好，为进一步的实验研究奠定了良好的模型基础。

参考文献:

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1) :84-91.

［2］窦倩，谢肄聪.三种不同剂型大黄对大鼠泻下作用的影响［J］.天津中医药，2011，28(6) : 510-512.

通信作者:谢肄聪

基金项目:天津市卫生局中医中西医结合科研项目(11106)。

文章编号:1002-266X(2015)19-0025-03

文献标志码:A

中图分类号:R743

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.008