人心脏干细胞获取量的影响因素及其亚群分析

席雷，李彤

(天津医科大学三中心临床学院，泰达国际心血管病医院，天津300070)

近年来，人们发现心肌组织中存在的心脏干细胞(CSCs)能够分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，具有较高的分化效率［1］。此外，CSCs由多个亚群组成，不同亚群的CSCs对心脏损伤修复有不同的作用。然而，目前关于CSCs分离培养的实验对象以鼠为主，缺少对人心肌组织CSCs(hCSCs)的研究，且CSCs数量较少，体外培养困难［2］。因此，2013年10月～2014年10月，本研究探讨了获取hCSCs的影响因素，并分析了hCSCs的亚群特征。

1 材料与方法

1.1 材料 组织来源:选取30例先天性心脏病患儿，男17例、女13例，年龄9个月～11岁(4.11±3.31)岁。术前与患者家属签订知情同意书，并保证实验过程符合伦理要求。在术中体外循环前，切取右心耳组织50 mg用于分离培养hCSCs。主要仪器及试剂:胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶(worthing公司，美国);抗体干细胞因子受体酪氨酸激酶(c-Kit)、胰岛素基因增强蛋白质(Isl-1)(SantaCruz公司，美国);细胞培养箱(Thermo Scientific公司，美国);免疫荧光共聚焦显微镜(Leica，美国);流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 hCSCs的分离与培养 将右心耳组织置于转移液中，整个转运时间小于30 min。去除表面脂肪组织后，将右心房组织剪成体积为1 mm3的碎块，使用PBS冲洗2次、每次3 min。将组织碎块置于含有0.05%胰酶以及0.1%Ⅰ型胶原酶的20 mL D-Hank＇s液内，在37℃恒温振荡器上低频振荡，消化5 min后，通过80目尼龙筛网，重新收集组织块，置于纤维蛋白包被的培养皿中，加入完全组织培养基0.5 mL，室温孵育1 h，再加入完全组织培养基1 mL后，放入37℃、5%CO2的孵箱中孵育，3～4 d更换一次培养基。孵育2周后，可见圆亮细胞出现。收集成团的圆亮细胞，用含有EDTA的PBS溶液冲洗2次，加入0.05%胰酶消化5 min后终止消化，将圆亮细胞接种在多聚D赖氨酸包被的孔板中，并在每个孔板中滴加500 μL心肌球培养基。收集心肌球接种至纤维蛋白包被的培养瓶中，培养并用于实验。

1.2.2 免疫荧光共聚焦染色观察c-Kit+、Isl-1+细胞的表达情况 细胞滴加至纤维蛋白包被的腔室玻片孔中，并以4%多聚甲醛固定。室温下，固定的细胞以含有10%山羊血清和0.1%Tween PBS溶液封闭 1 h，一抗孵育(c-Kit，1∶500;Isl-1，1∶500)，4 ℃过夜。PBS浸泡2次，每次5 min，吸水纸吸去液体，滴加二抗。使用含有DAPI的中性树胶封片。在荧光共聚焦显微镜下观察切片。

1.2.3 流式细胞术分析c-Kit+及Isl-1+细胞的比例 收集生长状态良好的hCSCs，用含0.5%BSA的PBS冲洗。将细胞悬液加在EP管中，待测细胞数≥105。在 EP管中分别加入抗体 c-Kit、Isl-1 2 μL，充分混匀，4℃避光孵育30 min，离心弃上清，PBS洗涤后再次离心弃上清。4%多聚甲醛400 μL重悬，移至流式上样管，上机检测。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，采用Pearson法分析年龄、性别与hCSCs数量的相关性。P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hCSCs分离培养的影响因素 培养心肌组织块1周后，可见成纤维细胞从组织块边缘爬出;2周后，在成纤维细胞层上出现圆亮细胞附着。每50 mg心肌组织中可获取(2.31±1.23)×104个hCSCs。经Pearson相关分析发现，hCSCs数量与年龄呈负相关(r=-0.869，P＜0.01)，与性别无相关性(r=0.027，P=0.87)。

2.2 hCSCs中c-Kit+、Isl-1+细胞所占比例 hCSCs Isl-1、c-Kit均阳性表达。在1×105的数量级中，Isl-1+细胞占(1.21±0.37)%，c-Kit+细胞占(3.28±0.94)%。

3 讨论

hCSCs表达胚胎及干细胞相关抗原，然而其数量有限且提取过程繁琐，进而制约了关于hCSCs的基础及临床研究。因此，如何获取及培养hCSCs是当前研究的焦点。心室、主动脉根部及右室流出道的心肌组织常用于获取hCSCs。然而，相比其他心肌位置，手术中获取右心耳组织方便，风险较低;且切除部分组织后对心功能影响不大。通过本实验，我们发现右心耳组织中可获取hCSCs，且形态良好，扩增稳定，因此，右心耳是获取hCSCs的首选位置。

目前有两种常用的hCSCs分离培养方法，即组织块分离培养法和心肌球培养法。本研究采用的方法是后者。虽然有学者提出，心肌球培养法需要特定的心肌球生长培养液以及多种细胞因子，费用昂贵［3］;但对于从幼儿右心耳提取原代hCSCs来讲，可较大程度上获取并保留具有多向分化特性的细胞。

Miyamoto等［4］从鼠心脏组织内成功分离了 c-Kit+细胞，这些细胞在传代40代后，依然具有干细胞特性并能分化为心肌细胞、平滑肌细胞及内皮细胞。c-Kit+细胞在5-氮杂胞苷作用下分化为心肌细胞［5］，进一步说明c-Kit+细胞是hCSCs的一类亚群。Isl-1+细胞参与心脏第二心区形成，在对鼠胚胎期细胞系示踪分析中发现，在参与胚胎期心脏形成的细胞中，2/3以上的细胞属Isl-1+［6］。大部分Isl-1+细胞定位于流出道并分化为心肌细胞，表达肌钙蛋白T及α平滑肌肌动蛋白［7］。本研究结果显示，hCSCs中c-Kit与Isl-1均阳性表达，以c-Kit+细胞为主。

有研究表明，供体的生理状态及组织来源决定了获取hCSCs的数量［8］。其中年龄是主要影响因素，随着年龄的增长，不但心肌组织中hCSCs的数量减少，且向心肌细胞分化的能力减弱［8，9］。本研究支持以上文献。因此，婴幼儿心肌组织是获取hCSCs的最佳来源。

应用hCSCs向心肌细胞分化及旁分泌的特点治疗小儿心力衰竭成为当前研究方案之一。非心源性干细胞的细胞核的转分化过程时间较长、效率较低，且获得的表型不够明确。hCSCs可直接分化为心脏的组成部分，更适宜治疗心力衰竭。最近的一项实验表明，2亿个骨髓间充质干细胞与1百万个c-Kit+细胞分别植入心肌梗死模型后，其临床效果相似，而c-Kit+细胞有更强的再生能力。

对hCSCs的研究可丰富干细胞移植治疗心血管疾病的方法，并且对解释心脏的起源与发育具有极为重要的意义。由于实验的局限性，本研究仅对hCSCs的分离培养及其与年龄、性别的相关性、亚群比例作出初步分析，在hCSCs分化为心肌细胞的机制等问题上需要进一步的研究。

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