高浓度葡萄糖体外对大鼠视网膜Müller细胞活性的影响及其机制探讨

曲虹，厉泉(山东省千佛山医院，济南250014)

高浓度葡萄糖体外对大鼠视网膜Müller细胞活性的影响及其机制探讨

曲虹，厉泉
(山东省千佛山医院，济南250014)

摘要:目的观察高浓度葡萄糖对体外培养大鼠视网膜Müller细胞活性的影响，探讨其作用机制。方法体外传代培养大鼠视网膜Müller细胞，随机分为N、G15、G25、G35组，分别给予DMEM培养基及含15、25、35 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基培养5 d。采用MTT法检测各组细胞光密度值( OD值，代表细胞活性)，采用细胞免疫化学染色、免疫荧光( FITC标记)染色及酶联免疫吸附试验检测低氧诱导因子1α( HIF-1α)和促红细胞生成素( EPO)蛋白。结果N、G15、G25、G35组细胞OD值分别为0.83±0.02、0.55±0.02、0.45±0.02、0.33±0.02，组间比较，P均＜0.01。N组未见HIF-1α、EPO阳性细胞，G15、G25、G35组可见黄染的HIF-1α阳性细胞及呈绿色荧光的EPO阳性细胞。N、G15、G25、G35组HIF-1α蛋白OD值分别为0.02±0.01、0.58±0.02、0.75±0.02、0.92±0.02，组间比较，P均＜0.01; EPO蛋白OD值分别为0.03±0.01、0.48±0.02、0.33±0.02、0.25±0.02，组间比较，P均＜0.01。结论高浓度葡萄糖可降低体外培养大鼠视网膜Müller细胞活性，促进细胞HIF-1α、EPO蛋白表达可能是其作用机制之一。

关键词:糖尿病视网膜病变;视网膜Müller细胞;葡萄糖;低氧诱导因子1α;促红细胞生成素

Effect of high glucose on cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and the mechanism

QU Hong，LI Quan
( Qianfoshan Hospital of Shandong Province，Jinan 250014，China)

Abstract:Objective To observe the effect of high glucose on the cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and to investigate the mechanism.Methods Rats'retinal Müller cells of serial subcultivation were divided into N，G15，G25，and G35groups which were cultured by DMEM medium or DMEM medium containing 15 mmol/L，25 mmol/L and 35 mmol/L glucose for five days，respectively.MTT assay was applied to detect the optical density ( OD value which represents the cell viability) in all groups.The expression of hypoxia-inducible factor-1α( HIF-1α) and erythropoietin ( EPO) was detected by immunochemistry，immunofluorescence and enzyme linked immunosorbent assay.Results The OD values of the N，G15，G25and G35groups were respectively 0.83±0.02，0.55±0.02，0.45±0.02 and 0.33±0.02，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).There were no positive cells of HIF-1α and EPO in the N group.Cells presented yellow positive expression of HIF-1α by immunochemistry and green fluorescence positive expression of EPO by immunofluorescence in the G15，G25and G35groups.The OD values of HIF-1α protein were respectively 0.02±0.01，0.58±0.02，0.75±0.02 and 0.92±0.02 in the N，G15，G25and G35groups，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).The OD values of EPO in the N，G15，G25and G35groups were respectively 0.03±0.01，0.48±0.02，0.33±0.02 and 0.25±0.02，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).Conclusion High glucose may decrease the cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and increase the expression of HIF-1α and EPO which may be one of its mechanisms.

Key words:diabetic retinopathy; retinal Müller cells; glucose; hypoxia inducible factor-1α; erythropoietin

糖尿病视网膜病变是糖尿病严重的眼部并发症，高浓度葡萄糖引起的视网膜微血管改变和神经细胞凋亡是其主要发生机制。Müller细胞是视网膜中重要的神经胶质细胞，对维持视网膜完整和正常功能等具有重要作用［1］。但是，高浓度葡萄糖对视网膜Müller细胞的影响及其与糖尿病视网膜病变发生的关系，目前尚不清楚。2011年12月～2014 年12月，本研究观察高浓度葡萄糖对体外培养大鼠视网膜Müller细胞活性的影响，探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料出生5～7 d的标准实验用清洁级Wistar乳鼠40只，雌雄不限，由青岛市动物实验中心提供。胎牛血清、DMEM培养液、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(美国Gibco公司)，D-葡萄糖、促红细胞生成素( EPO) (美国Sigma公司)，抗鼠低氧诱导因子1α( HIF-1α)、EPO单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，WIP细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京博奥森生物技术公司)，PV6001免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒和FITC标记二抗(北京中山生物技术公司)。

1.2视网膜Müller细胞传代培养及分组将Wistar乳鼠酒精浸泡处死，剥离视网膜，经胰蛋白酶、乙二胺四乙酸消化后，过筛网、离心、弃上清，加入含10%血清的DMEM培养液吹打重悬细胞，调整细胞密度为5×105个/mL，接种于多聚赖氨酸包被的25 cm2培养瓶内培养。培养24 h后第1次换液，之后每3 d换液1次，培养7～10 d时细胞融合达80%，以1∶2方式进行传代。每天用倒置显微镜观察培养细胞的生长过程及形态学变化，免疫细胞化学染色检测谷氨酰胺合成酶( GS)表达，以鉴定视网膜Müller细胞，取第3代细胞作为实验对象［2］。显微镜观察到第3代细胞胞体大、扁平，胞核清晰、核仁明显，胞质丰富，可见粗大突起，呈镶嵌样排列，细胞分界不清; GS阳性细胞达95%以上;满足实验要求。将上述培养细胞随机分为N、G15、G25、G35组，分别给予DMEM培养基及含15、25、35 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基培养。

1.3细胞活性检测各组培养5 d后，接种于96孔培养板，调整细胞密度为2×104个/mL，常规设5个复孔，并设立空白调零孔。培养液冲洗后每孔加入100 μL MTT溶液( 0.5 mg/mL)，室温下孵育4 h后，翻板弃去MTT溶液，每孔加200 μL二甲基亚砜，酶标仪570 nm波长处测各孔光密度值( OD 值)。OD值越高代表细胞活性越强。

1.4细胞HIF-1α、EPO检测①各组以每孔2× 104个/mL的密度接种于孔内预置1 cm2盖玻片的24孔板中，处理5 d后终止培养，吸出培养液，PBS冲洗、多聚甲醛固定，取出盖玻片置于载玻片上，羊血清封闭10 min，甩去多余液体，不洗。采用免疫细胞化学方法检测HIF-1α( 1∶100)，倒置显微镜下观察和照相;采用细胞免疫荧光( FITC标记)染色检测EPO( 1∶100)，荧光显微镜下观察和照相。②采用酶联免疫吸附试验检测HIF-1α、EPO蛋白。各组培养瓶内加入WIP细胞裂解液500 μL提取蛋白，调整各组蛋白质浓度为5 μg/mL;接种于96孔板，每组设6个复孔，并设立空白对照孔和阴性对照孔，酶标仪检测495 nm波长处各孔OD值。

1.5统计学方法采用SPSS11.5统计软件。计量资料以珋x±s表示，多组样本均数间比较采用单因素方差分析，组间多重均数的两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组细胞活性比较N、G15、G25、G35组细胞OD值分别为0.83±0.02、0.55±0.02、0.45± 0.02、0.33±0.02，组间比较，P均＜0.01。

2.2各组细胞HIF-1α、EPO蛋白表达比较①N组未见HIF-1α、EPO阳性细胞，G15、G25、G35组可见黄染的HIF-1α阳性细胞及呈绿色荧光的EPO阳性细胞。②N、G15、G25、G35组HIF-1α蛋白OD值分别为0.02±0.01、0.58±0.02、0.75±0.02、0.92± 0.02，组间比较，P均＜0.01; EPO蛋白OD值分别为0.03±0.01、0.48±0.02、0.33±0.02、0.25± 0.02，组间比较，P均＜0.01。

3　讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病严重危害视力的眼部并发症之一，其发病与糖尿病病程有一定关系，持续的高糖、缺氧、缺血是糖尿病视网膜病变发生、发展的刺激因素［3］。研究发现，高糖环境不仅引起微血管的改变，还可引起神经节细胞、光感受器细胞等视网膜神经元的损伤、变性、凋亡，最终导致视力的丧失［4］。Müller细胞是一种胶质细胞，构成视网膜内精细的神经胶质细胞网［5］。Müller细胞在视网膜正常的生理活动中发挥重要作用，如营养和支持视网膜神经细胞，参与“血-视网膜屏障”的形成，传递神经细胞信号［6］。此外，Müller细胞还参与多种视网膜病理过程，在缺血缺氧性视网膜病变的神经损伤及再生过程中发挥重要作用［7］。由于Müller细胞对维持视网膜正常结构功能、调节神经元活动具有重要作用，所以保持Müller细胞正常生理功能状态对整个视网膜功能的维持具有重要意义［8］。本

研究选用15、25、35 mmol/L这3个高糖干预浓度，观察不同浓度高糖对视网膜Müller细胞的影响。结果发现，G15、G25、G35组细胞活性明显低于N组，提示这3个高糖浓度均会引起Müller细胞的损伤; G35组细胞活性低于G25组，G25组细胞活性低于G15组，提示Müller细胞高糖损伤程度与葡萄糖浓度呈正相关。

心、脑等重要组织存在一种内源性保护现象，细胞感受低氧刺激可改变有关基因的表达，以提高细胞对损伤的耐受力［9］。低氧可提高细胞HIF-1α及其下游基因的表达，这些基因可使细胞防御功能增强，保护细胞免受进一步的损伤，上述基因被称为低氧相关基因，包括HIF-1以及HIF-1下游的EPO和血管内皮生长因子等靶基因［10］。本研究结果显示，N组未见HIF-1α和EPO蛋白阳性表达，而G15、G25、G35组均可见HIF-1α和EPO蛋白阳性表达。酶联免疫吸附试验结果显示，HIF-1α蛋白表达随葡萄糖浓度升高而增加; EPO蛋白在15 mmol/L葡萄糖浓度时表达明显增加，之后随着葡萄糖浓度升高而下降。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成，其中HIF-1α起活性作用［11］。正常氧状态下，细胞不断合成HIF-1α蛋白，又迅速被酶降解系统降解，所以N组无法检测到HIF-1α蛋白表达［12］。HIF-1 DNA结合活性和转录活性虽受到氧分压严格调节，但是HIF-1可以被多种细胞外刺激活化，无论缺氧或非缺氧情况，氧自由基和非自由基氧活性物质均可参与HIF-1活性的调节［13］。氧化应激水平的增高与糖尿病视网膜病变的发生、发展有关，这可能与高糖状态下糖代谢、脂代谢紊乱导致自由基生成增加，而清除系统明显受损有关［14］。HIF-1α是双重作用因子，在一定条件下可产生抗凋亡等保护作用，但是超过一定的量，就会发挥促凋亡和促新生血管的作用［15］。本研究中15 mmol/L葡萄糖作用于细胞时，刺激Müller细胞启动内源性自我保护机制，HIF-1α表达增加并诱导下游基因EPO表达增加;但当葡萄糖浓度过高时，细胞损伤进一步加重，细胞功能下降，尽管HIF-1α表达继续增加，但EPO蛋白表达下降，此时HIF-1α可能发挥促凋亡和促新生血管生成的作用。

总之，高浓度葡萄糖可导致体外培养大鼠视网膜Müller细胞损伤，诱导细胞HIF-1α、EPO蛋白表达增加可能是其损伤机制之一，但其具体作用机制还需要进一步研究。

参考文献:

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收稿日期:( 2015-04-20)

通信作者简介:厉泉( 1973-)，男，副主任医师，主要研究方向为心血管疾病。E-mail: liquann@163.com

作者简介:第一曲虹( 1973-)，女，副主任医师，主要研究方向为玻璃体视网膜病变。E-mail: qh1009@126.com

基金项目:山东省自然科学基金资助项目( ZR2011HL057; ZR2013HM028)。

文章编号:1002-266X( 2015) 28-0015-03

文献标志码:A

中图分类号:R587.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.005