大孔吸附树脂分离纯化广山楂总黄酮的最佳工艺条件及参数探讨

陈洪涛，刘源焕，覃学谦，蔡丹昭

(1广西中医药大学制药厂，南宁530023；2广西中医药大学第一附属医院；3广西医科大学)

大孔吸附树脂分离纯化广山楂总黄酮的最佳工艺条件及参数探讨

陈洪涛1，刘源焕1，覃学谦2，蔡丹昭3

(1广西中医药大学制药厂，南宁530023；2广西中医药大学第一附属医院；3广西医科大学)

目的 探讨大孔吸附树脂分离纯化广山楂总黄酮的最佳工艺条件及参数。方法 以静态和动态两个方面的饱和吸附量及洗脱率为指标，比较非极性树脂D101、弱极性树脂AB-8、中极性树脂HPD-450用于广山楂总黄酮分离纯化的优劣，并通过考察总黄酮回收率，优化所选最佳树脂的吸附工艺参数。结果 D101、AB-8、HPD-450静态饱和吸附量分别为94.802、118.494、98.317 mg/g干树脂，静态洗脱率分别为83.434%、91.253%、86.831%，洗脱液总黄酮量分别为91.490、115.567、98.528 mg，总黄酮洗脱率分别为85.852%、93.217%、89.051%。以5倍树脂体积的70%乙醇洗脱，流速1.5 mL/min，所得总黄酮回收率为94.09%，纯度为73.77%。结论 AB-8 型树脂综合性能最好，其最佳吸附工艺参数为以5倍树脂体积的70%乙醇洗脱，流速1.5 mL/min。

广山楂总黄酮；大孔吸附树脂；分离纯化

大孔吸附树脂由聚合单体和交联剂、分散剂、致孔剂等经聚合反应而制备，是一类有机高聚物吸附剂，目前已在多种植物黄酮类化合物的分离提纯中广泛应用，有较好的分离纯化效果[1～3]。由于现阶段对广山楂所含黄酮类化合物的化学性质研究不多，难以确定采用哪类大孔吸附树脂对广山楂总黄酮进行分离纯化会达到最佳效果。因此，2013年9月～2014年3月，我们选用了3种不同极性的大孔吸附树脂(非极性树脂D101、弱极性树脂AB-8、中极性树脂HPD-450)，通过对静态、动态饱和吸附量及洗脱率的考察，以确定可用于广山楂总黄酮分离纯化的最佳大孔吸附树脂及其分离纯化工艺参数。

1 仪器与材料

1.1 仪器 SB-5200D超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(巩义市科瑞仪器有限公司)，UV-2500分光光度计(日本岛津公司)，600型三用水箱(常州澳华仪器有限公司)，RE-2000E旋转蒸发仪(杭州亿捷科技有限公司) 等。

1.2 材料及试剂 广山楂，购于广西药材站，由广西中医药大学韦松基教授鉴定为台湾林檎的干燥成熟果实；芦丁对照品，购自中国药品生物制品检定所；AB-8大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂)， D101大孔吸附树脂(天津骨胶厂)，HPD-450大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司)；硝酸铝，氢氧化钠，亚硝酸钠，无水乙醇等其他试剂皆为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量的测定

2.1.1 标准曲线的绘制 参考文献方法[4]，精密称取20 mg 已于120 ℃干燥的芦丁对照品，置于100 mL容量瓶中，加适量70%乙醇溶解后定容，即获得芦丁标准对照液(0.2 g/L)。分别精密移取0、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mL芦丁对照液于25 mL容量瓶, 补充70%乙醇达6 mL，再分别加入0.75 mL亚硝酸钠溶液(50 g/L)，摇匀后静置6 min；再加入0.75 mL硝酸铝溶液(100 g/L)，摇匀后静置6 min；加入10 mL氢氧化钠溶液(40 g/L)，以70%乙醇定容，摇匀；静置15 min后，以第1瓶溶液为空白调零，测定各瓶溶液510 nm吸光度值；并以浓度(C)及所测吸光度值(A)进行线性回归。回归方程：A=8.436 7×C-0.058；r=0.999 0。

2.1.2 样品的测定 将不同条件所获洗脱液定容至所要求体积，精密量取0.2 mL液体样品，置于25 mL量瓶中，从补充70%乙醇达6 mL起按2.1.1项所述操作。测定溶液510 nm的A值，按上述回归方程计算各样品的总黄酮浓度，并按以下公式计算洗脱液样品的总黄酮量及样品的总黄酮回收率。总黄酮量(mg)=样品体积×样品总黄酮浓度；总黄酮回收率=洗脱液中总黄酮量/供试液中总黄酮量×100%

2.2 广山楂总黄酮供试液的制备 精确称取10 g广山楂粉(经干燥后粉碎并过40目筛)，置250 mL锥形瓶；以16倍体积的70%乙醇经超声辅助提取3次，每次提取时间为40 min；提取液滤过后合并，重复提取20次，合并滤液；减压回收溶剂后，药液以蒸馏水定容至500 mL，即获广山楂供试液(A)。取适量A液按2.1.2项所述操作检测其总黄酮浓度，结果显示A液总黄酮浓度为13.39 mg/mL。

2.3 3种大孔吸附树脂的预处理 分别取适量备选的3种大孔吸附树脂(HPD-450、AB-8、D101)，以95%乙醇浸泡24 h后湿法装柱；以大量95%乙醇清洗树脂，至流出液按1∶5与水混合时无白色混浊为止；然后改以大量蒸馏水洗柱，直至流出液无醇味。

2.4 分离纯化广山楂总黄酮最佳树脂的筛选

2.4.1 3种待选树脂对广山楂总黄酮的静态吸附—洗脱情况观察

2.4.1.1 静态饱和吸附情况观察 取3个100 mL具塞锥形瓶，分别精密称取3 g经预处理的湿树脂，各加入15 mL A液；3 h内每10 min振摇锥形瓶30 s；分别于室温静置19、21、23、25 h时，各取0.2 mL上清液，按2.1.2项所述操作，考察3种待选吸附树脂对广山楂总黄酮的静态吸附。结果静置23 h后，3种待选树脂对广山楂总黄酮的静态吸附均达到饱和。

2.4.1.2 静态吸附—洗脱情况观察 各精密称取3 g经预处理的3种湿树脂(另各称取3 g湿树脂120 ℃干燥至恒重，以计算干湿树脂的重量比)置于100 mL具塞锥形瓶中；各加入15 mL A液，3 h内每10 min振摇30 s；室温静置23 h，使各树脂达到静态饱和吸附。滤出上清液，定容至25 mL，按2.1.2项所述操作，测定并计算各上清液的总黄酮量及各树脂的静态饱和吸附量。去除上清液后，将树脂置于另一100 mL具塞锥形瓶中；加20 mL 95%乙醇，3 h 内每10 min振摇30 s；室温静置23 h，取上清液，95%乙醇定容至25 mL，按2.1.2项所述操作，测定并计算各静态洗脱液中广山楂总黄酮量及各树脂的静态洗脱率。静态饱和吸附量(mg/g干树脂)=(A液总黄酮量-吸附后上清液总黄酮量)/干树脂量；静态洗脱率(%)=洗脱液总黄酮量/(A液总黄酮量-吸附后上清液总黄酮量)×100 %。结果见表1。

2.4.2 3种待选树脂对广山楂总黄酮的动态吸附—洗脱情况观察 各精密称取3 g(湿重)经预处理的3种待选树脂，湿法装柱(1.5 cm×20 cm)；分别精密吸取15 mL A液，上样后以蒸馏水洗脱至流出液无色，再以95%乙醇洗脱，分别收集上样流出液、洗脱液；回收溶剂后均定容为25 mL，按2.1.2项所述操作，测定并计算各树脂对广山楂总黄酮的动态饱和吸附量及其洗脱率。动态饱和吸附量(mg)=上样总黄酮量-上样流出液总黄酮量；洗脱率(%)= 洗脱液总黄酮量/动态饱和吸附量×100 %。结果见表2。

2.5 AB-8型树脂分离纯化广山楂总黄酮工艺参数的优化

2.5.1 确定最佳洗脱剂体积分数 精密称取5份各3 g(湿重)AB-8型树脂，湿法装柱(1.5 cm×20 cm)；精密吸取A液各5 mL，分别上柱，以蒸馏水洗至流出液无色后，再分别以20%、30%、50%、70%、95%的乙醇洗脱，至洗脱液无色，分别收集洗脱液；回收溶剂后定容为25 mL，按2.1.2项所述进行操作，测定并计算各体积分数洗脱液中总黄酮回收率。总黄酮回收率(%)=(洗脱液总黄酮量/上柱总黄酮量)×100%。结果见表3。

2.5.2 确定洗脱液流速 制备4根AB-8型树脂柱(1.5 cm×20 cm，3 g湿树脂)，分别精密吸取5 mL A液上样；以蒸馏水洗至流出液无色后，再以70%乙醇洗脱，流速分别设定为1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min；洗脱至流出液无色后，分别收集各洗脱液；回收溶剂并定容至25 mL，按2.1.2项所述操作，测定并计算不同流速洗脱液的总黄酮回收率。结果见表3。

2.5.3 确定洗脱液用量 制备AB-8树脂柱(1.5 cm×30 cm，10 g湿树脂)，精密吸取15 mL A液上样；以蒸馏水洗至流出液无色后，再用70%乙醇以1.5 mL/min 的流速洗脱；按每15 mL(1 BV)为1个流分收集洗脱液，共分别收集10流分；按2.1.2项所述操作，测定并计算各洗脱液所含总黄酮量，绘制洗脱曲线(见图1)。

2.5.4 确定吸附—洗脱周期 按照以上筛选结果所确定的最佳纯化工艺条件，精密称取AB-8型湿树脂10 g装柱(1.5 cm ×30 cm)，准确吸取15 mL A液上样；以蒸馏水洗至流出液无色后，以5倍柱体积的70%乙醇，按1.5 mL/min流速洗脱；收集洗脱液，以此做为1个吸附—洗脱周期。在同一柱子上重复9个周期，将每个周期收集的洗脱液分别回收溶剂后定容至25 mL，按2.1.2项所述进行操作，测定并计算各周期的总黄酮回收率。结果见表4。

2.6 测定经AB-8型树脂分离纯化后的广山楂总黄酮纯度 制备AB-8型树脂柱(1.5 cm×30 cm，10 g湿树脂)，准确吸取15 mL A液上样；以蒸馏水洗至流出液无色后，以5倍柱体积的70%乙醇按1.5 mL/min流速洗脱；洗脱液合并后回收溶剂，定容为25 mL；按2.1.2项所述操作，测定并计算洗脱液总黄酮量。另取洗脱液10 mL于平皿中，以60 ℃烘干至恒重，以计算所纯化的广山楂总黄酮纯度。结果其纯度为73.77%，RSD=0.77%(n=3)。

3 讨论

山楂功可消食化积、活血化瘀，国内常用的山楂药材资源为蔷微科山楂属植物山里红及山楂的干燥成熟果实[5]。常用山楂主要含有黄酮类、低聚黄烷类、有机酸类、微量元素, 另外还有含有三萜类、甾体类和有机胺类等成分[6]。近年来对山楂及山楂叶总黄酮的药理药效研究较多，发现其具有抗心肌缺血、保护血管内皮细胞、调血脂及抗肿瘤等多种药理作用[7～10]，应用前景非常广泛。

广山楂为蔷薇科苹果属植物台湾林檎，别名尖嘴林檎、大果山楂等，主产于广西贺州、桂林、柳州、百色等地。在广西将广山楂作为山楂的习用品已有80多年历史[11]，而目前对于广山楂药理、药效学研究的报道还较少。有研究认为，广山楂含有丰富的黄酮类成分[12]，可能是其活血化瘀的物质基础。我们在前期实验中已确定了广山楂总黄酮的提取工艺[13]，但如何获得纯度较高的广山楂总黄酮仍有待研究。

大孔吸附树脂对中药总黄酮类成分有较好的富集作用，但不同类型的大孔吸附树脂有不同的吸附特性。为了制备纯度高的广山楂总黄酮，我们选取了不同极性的3种型号大孔吸附树脂(D101、AB-8、HPD-450)，通过考察各型树脂对广山楂总黄酮的静态、动态吸附—洗脱情况，发现3种待选树脂中，弱极性的AB-8型大孔吸附树脂对广山楂总黄酮的富集纯化能力最佳。研究发现，采用AB-8型树脂富集广山楂总黄酮的最佳工艺条件为：采用拟纯化总黄酮量10倍量以上的干树脂，以5倍树脂体积的70%乙醇为洗脱剂，洗脱剂流速为1.5mL/min，树脂重复使用3次后需进行再生。以此最佳工艺条件操作，以AB-8型大孔吸附树脂富集并纯化的广山楂总黄酮回收率可达94.09%，所获总黄酮纯度可达73.77%。此方法操作简便、成本低、收率高，易于进行大规模生产。

[1] 于智峰,王敏.大孔吸附树脂在黄酮类化合物分离中的应用[J].中药材,2006,29(12):1380-1384.

[2] 陈洪涛,蔡丹昭,林立波.大孔吸附树脂分离纯化榕树叶总黄酮的实验研究[J].广西中医学院学报,2008,11(2):43-46.

[3] 蔡丹昭,刘华钢,陈洪涛.大孔吸附树脂分离纯化番石榴叶总黄酮的研究[J].生命科学研究,2008,12(1):57-60.

[4] 陈洪涛,蔡丹昭,林立波.榕树叶总黄酮超声提取工艺条件的研究[J].时珍国医国药,2008,19(8):1955-1957.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010：372.

[6] 刘家兰,徐晓玉.山楂的药理作用研究进展[J].中草药,2009,40(增刊):63-66.

[7] 闵清,白育庭,张志,等.山楂叶总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心电图、NO及丙二醛变化的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2007,12(7):800-803.

[8] 兰文军,葛亚坤,郑筱祥.山楂叶总黄酮对缺氧人脐静脉内皮细胞细胞毒、一氧化氮和Ca2+水平的调控作用[J].航天医学与医学工程,2005,18(2):157-1601.

[9] 杨宇杰,王春民,党晓伟,等.山楂叶总黄酮对高脂血症大鼠血管功能损伤的保护作用[J].中草药,2007,38(11):1687-1690.

[10] 张妍,李厚伟,孙建平,等.山楂果总黄酮的提取分离及体外抗肿瘤活性[J].中草药,2004,35(7):787-789.

[11] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准(1990年版)[M].南宁:广西科学技术出版社,1992:21,22,139-141.

[12] 陈勇,甄汉深,董艺.广山楂及其叶质量分析研究[J].时珍国医国药,1999,10(7):511-513.

[13] 覃学谦,陈洪涛,刘源焕,等.广山楂总黄酮超声提取工艺条件研究[J].广西中医药大学学报,2014,17(1):68-70.

Discussion of the optimum conditions and parameters of separation and purification of total flavones from Malus doumeri (Bois) Chev by macroreticular resin

CHENHong-tao1,LIUYuan-huan,QINXue-qian,CAIDan-zhao

(1TheAffiliatedPharmaceuticalFactoryofGuangxiUniversity,Nanning530023,China)

Objective To explore the optimum technological parameters of the separation and purification process of total flavones from Malus doumeri (Bois) Chev with macroreticular resins. Methods With the static and dynamic saturated adsorption and elution rate as index, compare the advantages of nonpolar resin D101, weak polarity resin AB-8, medium polarity resin HPD-450 used in isolation and purification of total flavones from Malus doumeri (Bois) Chev, and optimize the adsorption process parameters of selected optimum resin by investigating the total flavones recovery rate. Results The static saturated adsorption of D101, AB-8, HPD-450 were 94.802, 118.494, 98.317 mg/g dry resin, the static elution rate were 83.434%, 91.253% and 83.434% respectively; the amount of total flavones eluted were 91.490, 115.567, 98.528 mg, elution rate were 85.852%, 93.217% and 89.051% respectively. Eluted with five times resin volume of 70% ethanol, flow rate of 1.5 mL/min, the recovery rate of total flavones was 94.09%, the purity of which was 73.77%. Conclusion The comprehensive performance of AB-8 resin was the best, the optimum process parameters were that of eluted with five times resin volume of 70% ethanol and 1.5 mL/min flow rate.

total flavones of Malus doumeri (Bois) Chev; macroreticular resin; separation and purification

国家自然科学基金资助项目(81360688)；广西自然科学基金资助项目(2012GXNSFAA239008)；广西壮族自治区卫生厅中医药民族医药自筹经费课题项目(gzzc1203)； 广西壮族自治区教育厅广西高等学校科研项目(201204LX195)。

陈洪涛(1973-)，学士，高级工程师，研究方向为中药新药开发及中药制剂质量控制。E-mail: 2427668099@qq.com

蔡丹昭(1972-)，副教授，博士，研究方向为中药药理的分子机制。E-mail: danzhaoc@sina.com.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.08.003

R284.1

A

1002-266X(2015)08-0007-04

2014-09-21)