栀子中两种环烯醚萜类成分的提取分离鉴定及不同产地含量比较*

王钱 马敏敏 杨敏春 万晓青

（浙江中医药大学·杭州 310053）

栀子来源于茜草科植物栀子（Gaedenia jasminodies Eills）的干燥成熟果实。性喜温暖湿润气候，好阳光但又不能经受强烈阳光照射，适宜生长在疏松、肥沃、排水良好、轻粘性酸性土壤中，产于山东、江苏、安徽、浙江等。性苦、寒，归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒，外用消肿止痛的功效[1]。现代药理学研究表明：栀子具有解热镇静、保肝利胆等功效，临床上用于治疗急性黄疸性肝炎、止痛、扭挫伤、冠心病[4]。在天然药物化学成分的研究中，萜类成分一直是研究的热点，亦是寻找和发现天然药物生物活性成分的重要来源。环烯醚萜类成分属于单萜类化合物，是蚁臭二醛的缩醛衍生物，是许多中药的主要有效成分。环烯醚萜类成分广泛存在于植物界，在玄参科、茜草科、唇形科、龙胆科、马鞭草科、木犀科等双子叶植物中均有分布。本文对栀子中两种环烯醚萜类成分京尼平龙胆双糖苷和京尼平苷的提取分离鉴定进行了研究，为栀子今后的质量控制提供依据。

1 仪器与材料

Agilent 1000 高效液相色谱仪( 美国Agilent 公司) ，Sephadex LH-20 凝胶( 瑞士 Phar-macia 公司) ，Diaion HP20 树脂( 德国化学公司)，ODS C18反相硅胶(美国化学公司) ，LC-9210NEXT型制备液相( 德国化学公司)，LGJ-10D 型冷冻干燥机( 北京四环科学仪器厂有限公司)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

栀子药材购于河南（郑州保佰德生物科技有限公司）、江西（萍乡市栀子花中药材种植有限公司）、福建（福建省康宝栀子产业有限公司）、江苏（江苏淮阴医药有限公司）、安徽（安徽康之源药业有限公司）、四川（四川硕康植物原料有限公司）等地，经本校胡保国老师鉴定均是为茜草科植物栀子 Gardenia jasminoides的干燥成熟果实。

2 提取分离及鉴定

称取干燥果实2kg，粉碎，以6倍量的60%乙醇加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，即得栀子浸膏0.73kg。取上述浸膏200g，用适量水超声溶解，装于大孔树脂柱子上，0.5bv水冲洗后用40%乙醇冲洗，将洗脱液干燥得富集物130g。称取大孔树脂分离的40%乙醇提取物1g，加入10%甲醇2ml，超声并加热溶解制成0.5g/ml的溶液，过0.22um微孔滤膜后，注入已平衡好的ODS柱上，用LC-9210NEXT型制备液相进行分离，分离条件及洗脱条件见表1及表2。100-136min两个峰纯度达到95%以上，单独收集得白色粉末并且分离的纯品均能达到20mg以上，可以用于结构鉴定及定量分析。

表1 制备液相条件

表2 梯度洗脱条件

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末。1H-NMR（400MHz，DMSO-d6）给出了δ：7.46（1H，s，H-3），5.69（1H，s，br s，H-7），5.11（1H，d，J=5.6Hz，H-1），5.06（1H，d，J=7.6Hz，H-1′），3.66（3H，s，COOCH3）。根据糖端基质子JH-H数值（J=7.6Hz，8Hz）判断葡萄糖端基构型为β型，鉴定为京尼平-1-β-龙胆双糖苷。其信号归属如下：1H-NMR（400MHz，DMSO-d6）给出了δ：7.46（1H，s，H-3），5.69（1H，s，br s，H-7）,5.11（1H，d，J=5.6Hz，H-1），5.06（1H，d，J=7.6Hz，H-1′），4.85（1H，d，J=8.0Hz，H-1″），3.66（3H，s，COOCH3）。综合上述分析，推出化合物可能为京尼平苷龙胆双糖苷，将此化合物光谱数据与文献[5]京尼平龙胆双糖苷(genipin-1-β-D-gentiobioside)光谱数据对照基本一致。

化合物2：白色粉末（氯仿），薄层鉴识，紫外光下呈亮蓝色荧光。mp163～164 ℃，EI-MS m/z：411[M＋Na]+（C17H26O10）其信号归属如下：1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6） δ：7.37（1H，s，C3-H），5.66（1H，br s，C7-H），5.28（1H，d，J=4.8 Hz，C1-H），3.65（3H，s，COOCH3），4.72（1H，d，J=5.2Hz，C1′ -H）。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）给出两个烯氢质子δ：7.46（1H，s），5.67（1H，br s），1个甲氧基δ：3.68（3H，s），据此推断此化合物可能为环烯醚萜苷类化合物，将此化合物的光谱数与文献[6]报道京尼平苷的数据对照基本一致，故鉴定此化合物为京尼平苷（geniposide）。

4 含量测定

4.1 色谱条件

色谱柱为agilent TCC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：0.1%甲酸水（A相）；乙腈（B相）； 柱温40℃；流速：1ml/min；检测波长240nm。，进样量5ul，京尼平龙胆双糖苷和京尼平苷分离良好，见图1。

图1 栀子样品高效液色谱图

4.2 制备对照品溶液

精密称2种对照品（纯度均大于99%）适量，分别置于25mL 容量瓶中，配制60%甲醇并用其超声溶解并定容，摇匀，即得。依次精密吸取对照品溶液适量至10mL量瓶中，60%甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为 0.1369，0.1275g/L的混合对照品溶液，放置于冰箱中，即得。

4.3 制备供试品溶液

称取适量干燥栀子粉末约0.7g，精密称定置具塞锥形瓶中，精密加入配制好的60%甲醇30mL，封闭，称量，超声50min，取出放至室温，60%甲醇补足失重，摇匀后10000r·min－1离心30 min，上清液以0.45um微孔滤膜滤过，即得。

4.4 线性关系考察

精密取混合对照品溶液 1、2、4、6、8、10ul，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得成分1线性关系Y=1.834*103X+0.367（r=0.9999）， 成 分2线 性 关 系Y=1.898*103X-3.798(r=0.9999)。说明两成分与峰面积呈良好的线性关系。

4.5 精密度测定

精密吸取4.2项下混合对照品溶液5μL，相同色谱条件下于2d和5d内连续进样，测定峰面积，结果2个成分峰面积的精密度RSD分别为 0.11%，0.16%。

4.6 重复性试验

取本实验同一批栀子药材粉末8份，按上述方法进样测定，结果成分 1 和 2 的平均质量分数分别为2.96，2.47 mg·g－1，RSD依次为1.5%，1.6%，表明该方法重复性良好。

4.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于制备后 0，3，6，9，12，18 ，24h 按上述方法进样测定，结果成分1和2峰面积的RSD分别为0.68%，0.68%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

4.8 加样回收率试验

取本实验已知含量样品粉末8份，每份约 0.30 g，精密称取，在药材中加入等量对照品按上述方法测定，计算加样回收率，成分1和2的平均回收率为100%，100%，RSD分别为0.28%，0.42%，结果见表3。

4.9 不同产地栀子含量测定

取6个产地栀子样品，按上述方法测定，以外标法计算，结果见表4。

表3 栀子中两成分加样回收率测定

表4 不同产地栀子中两成分含量测定

5 讨论

环烯醚萜类成分一般采用溶剂法提取，常选用的提取溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂，洗脱溶剂也主要是甲醇、水、乙腈。所以在分离过程中，需要低温，分离的馏分尽量冷藏保存，以防止酶和有机酸的影响导致环烯醚萜类变色，环烯醚萜类成分性质并不稳定，变色意味着成分改变，很难逆转，所以要谨防分离过程中成分变化。

京尼平龙胆双糖苷和京尼平苷属于环烯醚萜类成分，本实验采用方法能够快速、方便的分离纯化栀子中京尼平龙胆双糖苷和京尼平苷两种成分，同时发现不同产地栀子中两类成分含量有一定差别，河南、江西产含量稍微高一些，本实验为今后栀子中环烯醚萜类成分的质量控制提供依据。

[1]国家药典委员会，中华人民共和国药典一部，[M]．中国医药出版社，2010,231.

[2]苗明三,李振国．现代实用中药质量控制技术[M]．北京: 人民卫生出版社,2000: 708.

[3]孟祥乐,李红伟,李颜，等.栀子化学成分及其药理作用研究进展[J]．中国新药杂志,2011,20 (11) :959-967．

[4]Peng J,Qian ZY,Liu TZ,et al.Comparative studies on hepatic protective and choleretic effectof geniposide and crocetin.Chin J ofChin Mat Med,2003(2):105-108.

[5]Endo T,Taguchi H,A new iridoid glycoside from jasminoides Genipin-1-O-β-gentiobioside [J]. Chen Pharm Bull,1970,18:1065.

[6]Leticia J.Naggar I.Beal J L,et al.Iridoids A review [J].J Nat Prod,1980，43：649.