肿瘤患者自体外周血C I K/D C-C I K细胞培养制备技术及临床应用研究进展

祝仲珍 ，王占科 ，傅颖媛

(1、南昌大学基础医学院免疫学教研室，江西 南昌330006；2、解放军第九四医院检验科，江西 南昌330002)

生物治疗是除化学治疗、放射治疗和手术治疗以外的新型肿瘤内科治疗技术，自体免疫细胞治疗技术作为肿瘤生物治疗技术，被国家卫生计生委列入允许临床应用的三类技术，其中肿瘤患者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞 (Cytokine-induced Killer/Dendritic Cells and Cytokine-induced Killer cells，CIK/DC-CIK细胞)治疗技术是广泛应用于临床的三类临床医疗技术，其核心技术为肿瘤患者自体外周血CIK/DC-CIK细胞体外培养及其回输技术。现将国内外肿瘤患者自体外周血CIK/DC-CIK细胞培养制备技术与生物治疗研究进展，综述如下。

1 自体外周血C I K/D C-C I K细胞

1.1 自体外周血CIK细胞概念 自体CIK细胞是指在体外由多种细胞因子诱导患者自体外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclearcell,PBMC)而生成的异质细胞群。恶性肿瘤患者的免疫机能存在不同程度的受损害，CD3+、CD8+、CD56+细胞数量降低，增殖后的CIK细胞具有T细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤的特点。与PBMC相比，CIK细胞中 CD3+、CD8+、CD56+细胞比例明显升高，CIK 细胞对肿瘤细胞有很强的杀伤力，而且，CIK细胞越多，杀瘤效果越好。CIK细胞己成为过继细胞免疫治疗主要方法[1]。2009年，自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术已经列入国家卫生与计划生育委员会首批允许临床应用的第三类医疗技术[2]，免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术管理规范规定该技术适用于临床上已完成安全性和有效性认证，并符合伦理要求，只涉及T细胞和NK细胞作为治疗手段的医疗技术，这类技术包括自体CIK细胞、自体TIL细胞、自体DC/CIK细胞、自体CTL细胞、自体γδT细胞和自体NK细胞。这为肿瘤患者自体外周血CIK细胞培养技术与临床治疗研究成果转化提供法律保证。

1.2 外周血DC-CIK细胞概念 自体外周血DCCIK细胞是自体DC细胞和CIK细胞共同培养后生成的异质细胞群[3]。DC和CIK共培养24h后，IL12的分泌量是CIK细胞单独培养的6.93倍;可以高表达 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞， 低表达CD4+CD25+Treg细胞[4]，尽管DC细胞不具备直接杀伤肿瘤细胞作用，但DC细胞可刺激CIK细胞的增殖，分泌多种肿瘤杀伤细胞因子，比如TNFα和干扰素等[5]。自体外周血DC-CIK细胞抗肿瘤效果一般比CIK细胞好，但制备成本高。自身DC细胞与自身肿瘤抗原共刺激后，可增强抗肿瘤免疫应答，目前常用于肿瘤细胞疫苗的临床预防[6，7]。

2 自体外周血C I K/D C-C I K细胞培养与性能和安全指标检测

2.1 CIK/DC-CIK细胞体外诱导培养 CIK/DCCIK细胞体外诱导培养流程主要包括外周血单个核细胞分离，添加细胞因子(干扰素和IL-2)和淋巴细胞刺激分子(CD3单克隆抗体)体外诱导培养扩增等。CIK细胞培养技术是指通过贴壁等方法去除单核细胞(DC细胞)，只对淋巴细胞进行培养的技术；DC-CIK细胞培养技术是指外周血单核细胞(DC细胞)和CIK细胞分开培养，然后再共同培养的技术。DC-CIK细胞培养添加的细胞因子和CIK细胞培养添加的细胞因子有所不同，DC细胞的作用主要是肿瘤抗原提呈作用，为了增强DC-CIK细胞对不同肿瘤细胞杀伤的特异性，近年来，国内外学者提出肿瘤细胞抗原负载DC细胞培养，可增强DC-CIK细胞对特异肿瘤细胞的杀伤作用[8]。肿瘤细胞抗原负载DC细胞培养技术是指将肿瘤细胞抗原和DC细胞共同培养，共同培养后的DC细胞对肿瘤细胞识别能力增强，在患者体内对肿瘤抗原提呈给淋巴效应细胞的能力也增强，有文献报道，DC-CIK细胞在体外对肿瘤细胞具有更好的杀伤效果，而单纯的肿瘤抗原负载DC细胞可作为预防肿瘤的免疫细胞疫苗，在体内也可以发挥预防和抑制肿瘤细胞作用，DC-CIK细胞培养和制备，具有更好的临床应用前景[9]。

有关外周血DC细胞培养、CIK细胞培养以及DC-CIK细胞培养方法，文献报道很多[10，11]。DC细胞培养主要根据DC细胞的贴壁功能移去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入GM-CSF、IL4诱导DC细胞。抗原负载DC细胞培养在DC细胞培养过程中，根据患者肿瘤的类型添加自制或商品化的肿瘤细胞抗原，一般添加 IL-1β、IL6、TNF-α 后，培养一段时间收获抗原负载的DC细胞。CIK细胞培养在去除 DC 细胞后，添加 IFN-γ、IL2、抗-CD3、IL1培养收获CIK细胞。DC-CIK细胞培养先培养DC细胞和CIK细胞，然后再共同培养。

多种细胞因子可用于CIK/DC-CIK体外诱导培养，在培养体系中添加的细胞因子种类对CIK/DC-CIK细胞培养效率和CIK细胞群种类具有重要影响，目前研究较多的细胞因子为IL12和IL15。IL12是一种免疫调节因子，可增强NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒作用，诱导IFN-γ、TNF-α等分泌，也有文献报道,IL12可和其它细胞因子如IL1β、IL2、IL4一起共同诱导CIK/DC-CIK细胞中的NK细胞活化和增殖，IL12能增强CIK/DC-CIK细胞毒活性，可能机制是降低Treg细胞的数量和抑制细胞凋亡，从而诱导CIK细胞的抗肿瘤活性增强[12-14]。虽然IL15单独体外诱导不能显著提高CIK细胞群中NK细胞的比例，但与DC细胞联合培养，可大大提高DC-CIK细胞群中NK细胞比例，同时DC-CIK对靶细胞的杀伤作用也显著增强[15]。

2.2 CIK/DC-CIK细胞CD分子检测 CIK/DC-CIK细胞是以CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞为主的细胞群，随着培养时间的延长，CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞的百分率均呈上升趋势，而CD3+CD4+呈下降趋势。临床实验室常见的检测以CD3+CD8+和CD3+CD56+T细胞为主。

2.3 细胞毒活性测定 MTT法是常用方法。将培养后的DC-CIK细胞与肿瘤细胞株共培养，以DCCIK细胞为效应细胞，肿瘤细胞做为靶细胞，效靶比为5:1,10:1,20:1不等,37℃ 5%CO2培养24h，加入MTT试剂，继续培养4h，吸去培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。计算抑瘤率。由于MTT有致癌性，且要现配先用，现在已有CytoTox96非放射性细胞毒试剂盒可代替使用，操作简便。

2.4 质量与安全指标检测 加强感染控制工作是自体CIK/DC-CIK细胞制备和治疗安全有效的前提和保证。自体外周血CIK细胞培养制备需要在国家技术监督部门批准并验收的GMP(Good Manufacturing Practice)实验室中完成。为保证治疗质量，每次收集的细胞数应≥2×109个，活率应≥95%，CD3+CD56+细胞应占大多数，外源性因子(细菌、支原体、真菌、内毒素、病毒)检测合格。

3 自体外周血C I K细胞临床免疫治疗机理

自体外周血CIK、DC-CIK细胞至少包括细胞毒T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞、NK细胞和DC细胞以及一些尚未完全清楚的其它免疫细胞，这些CIK免疫细胞均有直接和间接杀伤或抑制肿瘤细胞的作用。自体CIK/DC-CIK杀伤肿瘤细胞的功能，已经在体内外实验得到证实。其杀伤机理基本明确[16-18]。CIK/DC-CIK的生物学活性主要是：(1)增殖速度加快，CIK细胞的主要效应细胞是CD3+CD56+细胞，在正常人外周血中只占1~5%，经过10~14d的诱导，CD3+CD56+细胞迅速增多；(2)CIK细胞是以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群，较以NK细胞为主的LAK细胞具有更强大的杀瘤活性；(3)抵抗效应细胞凋亡；有研究表明CIK细胞在培养中表达FasL，能抵抗FasL+肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡，又可诱导Fas+肿瘤细胞凋亡[19]。

4 自体外周血C I K/D C-C I K细胞治疗临床应用

目前临床上多采用化疗联合CIK/DC-CIK细胞治疗的方式对肿瘤患者进行抗瘤治疗，每次输入的CIK/DC-CIK细胞不低于1×109个，4周为 1个疗程，CIK/DC-CIK细胞治疗与化疗不应同时进行，一般间隔1~2周，为使治疗安全有效，在使用CIK/DC-CIK细胞治疗前应掌握禁忌症，在患者治疗后1、3、6个月和一年进行治疗效果评估。

4.1 胃癌 胃癌患者化疗后造成食欲下降和睡眠质量差，精神萎靡等症状。应用自体外周血CIK/DCCIK免疫细胞回输治疗联合化疗对进展期胃癌术后患者进行观察，结果发现整体治疗效果明显优于单纯化疗组，其3年和5年生存率也明显提高；胃癌相关肿瘤标记物CEA等含量明显低于单纯化疗组。许多文献报道，CIK治疗胃癌患者治疗效果还与CIK细胞的治疗次数明显正相关，提示外周血DC-CIK/CIK免疫细胞治疗可作为胃癌治疗的有效措施，联合化疗可明显提高肿瘤患者的治疗效果[20-22]。

4.2 肝癌 近年来许多学者研究观察了患者自体外周血CIK/DC-CIK治疗联合肝动脉栓塞化疗术(TACE)治疗原发性肝癌患者(HCC)的效果并进行评价，在TACE间歇期间，用患者自体外周血CIK细胞进行回输治疗，发现观察组生活质量(QOL)明显得到改善，1年生存率、3年生存率等指标均显著高于对照组，提示患者自体外周血CIK细胞免疫治疗可以提高HCC患者的生活质量,延长生存期，可作为其它治疗手段的有效辅助措施[23-25]。

4.3 乳腺癌 文献报道患者自体CIK细胞免疫治疗联合化疗治疗晚期复发转移性乳腺癌患者，效果明显优于单纯化疗,可延长患者的生存时间，明显降低患者厌食程度及疲倦乏力率,提高患者生活质量,对体质稍差的患者更加适合，可有效缓解化疗的毒副作用[26-28]。

4.4 肺癌 肺癌患者手术比较困难，化疗也容易出现耐药问题，预后差。张菁超等研究了患者自体外周血CIK治疗中晚期肺癌患者的效果，经CIK细胞治疗的患者血免疫球蛋白、T细胞亚群均得到明显好转，肺癌患者的CD3+CD4+T细胞和CD4+CD8+的比例明显高于治疗对照组。CIK免疫细胞治疗效率为42.9%,疾病控制率为83.3%，提示CIK免疫细胞治疗可通过调节机体免疫系统,提高治疗有效率,提高患者生活质量[29]。DC-CIK细胞联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的临床效果，DC-CIK联合治疗组患者的无进展生存期、总生存期及Karnofsky评分均高于单纯化疗组，提示DC-CIK细胞联合化疗可提高对非小细胞肺癌 (NSCLC)疗效,改善NSCLC患者生存质量,降低化疗的毒副反应[30-32]。

4.5 其它肿瘤 CIK或DC-CIK过继免疫细胞可用于胰腺癌、肠癌、肾癌、白血病以及黑色素瘤等治疗或联合治疗方面，安全性和有效性均有文献报道[33，34]。CIK/DC-CIK细胞治疗也存在严重的个体治疗差异，治疗有待进一步规范和管理，并进行多中心大样本临床疗效研究，才可以得出明确的疗效结论。

5 问题与展望

肿瘤免疫缺陷是导致肿瘤发生与发展的主要原因，无论手术、还是放疗和化疗都不是从改善患者免疫系统进行肿瘤治疗的，而且化疗无法彻底杀死静止期肿瘤细胞，容易造成肿瘤的复发[35]。自体外周血CIK细胞治疗技术治疗有一定的优势，主要表现在：(1)细胞免疫治疗不仅直接发生抗肿瘤作用，更重要的是纠正了患者细胞免疫功能低下的问题，促进患者抗肿瘤免疫功能[36]；(2)治疗可用于产生耐药性肿瘤患者的治疗；(3)对于失去手术机会或已复发转移的晚期肿瘤患者，能迅速缓解其临床症状，延长生存期[37]。自体外周血CIK细胞治疗尽管具有安全有效等优势，但当前仍存在一定的问题：一是回输前质量控制标准国内外尚不统一，必须满足一定的CIK细胞数和具有杀伤肿瘤细胞的免疫细胞百分比回输到体内，才能达到一定的治疗剂量；二是回输次数尚没有统一标准，而且受培养周期的约束；三是制备好的CIK细胞保存问题还存在困难，需要及时回输；四是不同肿瘤患者、同一肿瘤患者不同阶段的外周血CIK/DC-CIK在同样的培养条件下培养效果不同，这对标准化CIK/DC-CIK培养以及制定统一的标准操作程序(SOP)文件带来困难；五是在管理上CIK细胞制备、检测和应用应属于不同组织管理，互不隶属，互相监督，保证自体CIK/DC-CIK细胞治疗的安全性和可靠性。自体外周血CIK/DC-CIK细胞体外培养制备，回输等诸多环节尚需要规范和管理，在自体CIK/DC-CIK细胞制备方面，细胞因子种类很多，需要添加多少种细胞因子以及多少剂量，研究不同患者外周血CIK最佳培养体系组成，都值得进一步研究和探讨。

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