临床微生物的快速诊断的方法学研究进展

王秀媛综述，刘玉英审校

(宝坻中医医院检验科，天津 301800)

1 直接临床标本的检测

1.1 直接从临床标本中检测病原体成分及抗原应用单克隆抗体结合各种形式的标记技术可以检出临床标本中痕量的微生物抗原，免去细菌或病毒培养的过程，直接完成微生物感染的快速诊断。如应用斑点酶免疫测定(EIA)、荧光免疫试验(FIA)或金标法检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、肺炎支原体，快速、直观[1]；针对结核分枝杆菌的表面抗原或脂阿拉伯聚糖(GMA)制成单抗，用酶联免疫吸附试验(ELISA)或斑点酶免疫测定(EIA)直接检测标本中的TB抗原[2]，Hillemann等用CapiliaTB产品检测结核分枝杆菌MPB64抗原，在172例结核杆菌阳性的临床标本的检测中阳性检出率为97%，特异性达100%；直接检测粪便中的O157：H7大肠埃希菌抗原，Takeda等用胶体金免疫层析条直接检测水样便中的EHEC O157，报道检测限为5×l05cfu／ml，与培养法相比一致率为89.10%，与ELISA法相比一致率为87.2%，但胶体金免疫层析法用时仅5min[3]；又如直接检查粪便中的幽门螺杆菌抗原(HpSA),2004年国内文献关于HpSA免疫快检卡诊断HP感染的首次报道，其敏感性为92.6%．特异性为88.5%．总的检测准确性为90.6%[4]，该方法适用于幽门螺杆菌感染的大规模流行病学调查和临床诊断,也适用于HP的根除疗效观察和随访复查，更适用于老年于老人、儿童、孕妇及不宜做胃镜检查的患者，临床实验室可以把HpSA检测作为HP感染的常规检查项目,值得在临床实施和推广[5，6]；美国BinaxNow肺炎链球菌抗原检测试剂盒可直接用于尿液和脑脊液标本的检测，用于肺炎球菌性肺炎和肺炎球菌性脑膜炎的诊断；还有采用各种不同载体如聚苯乙烯粒子(Latex)、明胶粒子、碳末、含蛋白A的金黄色葡萄球菌、胶体金等制成凝集试剂，直接测定粪便标本中的轮状病毒、脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌、B型流感杆菌，以及链球菌的分群(A、B、C、D 等群)等。

真菌的检测，通过检测真菌细胞壁的β-1,3葡聚糖 (G试验)，β-1,3葡聚糖在有些真菌细胞壁>50%，用动态浊度法来检测，可检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、卡氏肺孢子菌，可用于以上真菌的早期诊断和动态反应感染程度及抗真菌治疗效果[7]，研究显示敏感性和特异性分别为(63%~100%)和(74%~100%)，缺陷在于容易引起假阳性，而且无法区别真菌种类[8]；半乳甘露聚糖(GM试验)试验，半乳甘露聚糖是曲霉菌细胞壁成分，菌丝在生长过程中释放，曲霉菌、隐球菌、青霉/拟青霉GM试验阳性，GM试验其灵敏度可达1ng/ml,ELISA检测血清中半乳甘露聚糖用于诊断曲霉具有良好的敏感性 (64.5%~100%)和特异性 (80%~98.7%)，可以用于曲霉的早期诊断和治疗监测；在临床试验中可通过G+GM试验对不同感染的真菌进行检测可提高试验准确度[9-11]。

1.2 检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定 已发现某些具有特征性的酶，应用适当的底物可迅速完成细菌鉴定。如沙门菌具有辛酸酯酶，以4MU-辛酸酯酶为底物，经沙门菌酶解，在紫外灯下观察游离4MU的荧光，国内已有应用[12]；卡他莫拉菌具有丁酸酯酶，可用丁酸酯酶色原底物快速鉴定；大肠埃希菌具有β-葡萄糖醛酸酶，但以O157：H7为代表的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)却不具此酶，故葡萄糖醛酸酶阴性以成为初步筛查EHEC的重要特征[13]；白念珠菌具有脯氨酸肽酶及N-乙酰β-D半乳糖苷酶，分别以适当的底物检测试验只需20min，两酶阳性为白念珠菌；难辨梭菌具谷氨酸脱氢酶(GDH)，应用此酶的IgG抗体(兔抗GDH)包被固相检测卡，应用双抗体夹心法检测粪便中的GDH[14，15]等。

1.3 快速检出细菌的毒素 自临床标本中直接检出细菌的毒素，常比细菌培养更可靠。已应用难辨梭菌的单抗以快速凝集或EIA法自粪便标本中直接检出毒素A或B进行诊断[16]；产毒素埃希菌(ETEC)感染的诊断主要依靠查细菌的热敏毒素(LT)与耐热毒素(ST)可应用其单抗以多种免疫学手段检出；应用反向被动乳胶凝集发 (Oxoid公司试剂)快速检测葡萄球菌的毒性休克综合征毒素-I(TSST-I),可及时诊断出球菌所致的中毒性休克综合征。

1.4 检测机体对感染的免疫应答 正常情况下，细胞因子的表达和分泌受机体的严格的调控，在炎症的情况，某些细胞因子的表达量可成百上千倍的增加。如白细胞介素(IL-6、IL-10、TNF-α)在炎症时可快速上升，且半衰期很短，可作为急性感染的早期辅助诊断；C反应蛋白(CRP)可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断，一旦发生炎症，CRP水平即升高，而病毒感染CRP大都正常，脓毒血症CRP迅速升高，而依赖血培养至少需要48h，且其阳性率不高，又如CRP能快速有效地检测细菌性脑膜炎，其阳性率达99%；降钙素原(PCT)在细菌性感染时3~4h即可升高，半衰期接近24h，能快速反馈治疗成效(每24h降低50%的浓度)，PCT反映感染的严重程度，健康者一般低于0.05ng/ml,局部感染在0.05~0.5ng/ml之间，全身性感染在0.5~2.0ng/ml，严重感染脓毒症一般在2-10ng/ml,而脓毒症休克>10ng/ml，根据PCT的测定值可以反映抗生素的治疗疗效，如PCT值在应用抗生素或更改抗生素后测定值持续下降，说明治疗是有效的，对细菌的感染诊断具有高特异性，可以改善临床诊断，血液中的水平快速升高，半衰期超过24h，随着疾病的进展和加重水平持续升高，感染有效控制后水平快速下降，有效指导抗生素的使用，检测方法方便，体内外稳定性高，不受糖皮质激素的影响，结合临床背景进行个体化诊断和治疗[17]；γ-干扰素释放试验(IGRA)结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞,效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子(IFN-γ)，有研究实验该方法敏感性为96.1%，特异性为95%;T-SPOT.TB是较灵敏和特异的快速检测结核分枝杆菌感染的方法[18]，因此检测效应T淋巴细胞可用于结核病和结核潜伏感染者的诊断，由于效应T淋巴细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可作为机体是否正处于被感染者的指标[19]。

2 细菌培养及药敏的快速试验

一系列的商品化的显色培养基进入临床微生物实验室，将标本直接接种所需的不同要求的显色培养基上进行筛选，大大缩短了临床致病菌的检测和鉴定时间还能降低实验室成本。如大家比较关注的艰难梭菌显色培养基、真菌显色培养基等[20]；还可以根据培养基生长的菌落颜色变化可判读是否为耐药菌株，如MRSA、ESBL、VRE、等培养基，比传统方法至少节约时间1~2d[21-23]；Nitrocefin纸片法可以快速检测培养出的革兰阳性球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌的β-内酰胺酶；快速鉴定MRSA和MRCNS的快速乳胶凝集试验(日本生研公司)可检出亲和力降低的青霉素结合蛋白 (PBP2a)[24]；BBL公司的MGIT(Mycobacterial Growth Inhibitor Tube)于结核杆菌TH9培养中加入异烟肼、利福平等药物及荧光指示剂，在365nm的紫外灯下观察有无荧光而判断敏感或耐药，试验仅需4~5h，从而实现快速结核分枝杆菌的药敏试验；Jacobs等将荧虫酶的基因导入结核杆菌的噬菌体，噬菌体只侵入活的结核杆菌而发出荧光，将菌体与一定浓度的药物作用后，如菌体存活则感染噬菌体，可在荧光显微镜下观察到荧光，即为耐药，无荧光者为敏感。

近十几年来，病原微生物的快速诊断方法发展很快，ELISA快速检测抗原及抗体技术已被普遍的应用，简化了过去繁琐的微生物学的检测手续，特别是采用单克隆抗体，进一步提高了检测的特异性和敏感性。目前已制备出许多诊断试剂盒，其中病毒的快速诊断试剂盒的广泛应用，使过去长期难以实现的病毒病的快速实验诊断成为现实。自动免疫分析仪的诞生，为感染性疾病的血清学诊断提供了许多简便、快速、灵敏和特异的新手段。20世纪90年代，分子生物学技术的发展，核酸杂交技术、基因测序和PCR扩增技术的应用，使某些不能培养、培养需很长时间和需特殊培养条件的微生物引起的感染性疾病的基因诊断成为可能[25-28]。随着新技术发展的日新月异，大大提高了医学微生物学检验诊断水平及效率。

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