培养基制作应注意的几个事项

古丽巴哈尔·斯迪克

(新疆库尔勒市阿瓦提乡畜牧兽医站,新疆库尔勒 841000)

培养基制作应注意的几个事项

古丽巴哈尔·斯迪克

(新疆库尔勒市阿瓦提乡畜牧兽医站,新疆库尔勒 841000)

培养基是人工制备的一种液体或固体营养物质,是细菌培养和保存细胞的基础。培养基应含有相应培养细菌所需的营养成分、PH、应无菌。培养基制造的基础材料为水、肉浸汁(肉汤)、蛋白胨、琼脂、明胶、酵母浸汁、盐类和化学试剂等。然而培养基的质量对生物药品的制造、分装及检验有着至关重要的作用,因此,在制作培养基时应特别注意。

细菌;酶;培养基;酶促反应

培养基是细菌的人工养料，根据细菌的不同要求用人工方法将各种养料配制在一起成为维持和繁殖细菌的基础，制备适用的培养基，提供细菌所需的营养物质和生长条件，了解其生长繁殖的规律，以提高生物制品质量和数量，提高对病原菌分离培养技术。故培养基的质量对生物药品的制造，分装及检验有着至关重要的作用。下面就是我在制作培养基生产过程中，对常遇到的一些关键性问题的认识与看法。

1 把好制作培养基原、辅料质量关

制作培养基的基础就是肉肝胃酶消化汤（浸出液），因而牛肉、牛、羊、肝、胃等基础原料要选择新鲜、无异嗅、无病变、有弹性、浸出液透明清朗，能提供丰富的营养成分。制备肉浸汁，除选好的材料外，浸渍方法也很重要，浸泡目的是使肉组织的水溶性营养物质充分的溶解在水中。经做过的冷浸法和热浸法煮肉汤的对比实验表明，冷浸法的效果要比热浸法好，现多采用冷浸法。由于菌种培养基要求比较高。因此配制时力求使用新鲜原材料，现配现用，以保证质量。不马上使用的肉汤等要先流通1h后送冷库保存备用。对于辅助材料，化学试剂等，都要先经厂化验室检验合格后方可使用。

2 制备血斜培养基应注意的几点

2.1 做好消毒准备工作

无菌间要彻底熏蒸消毒，采血器皿、分装物品均要先高压消毒，以防污染。无菌操作，严把质量关。

2.2 普通琼脂在未加血前的制作是很关键的

首先pH值要适宜，一般控制在8.0左右即可。另外加琼脂时也是有要求的。我们做过加粉状琼脂和条状琼脂的对比实验，结果加粉状琼脂的培养基加血后不溶血，呈片状，不能用。而加条状琼脂的加血后溶血，效果较好。因而制作鲜血琼脂培养基时，都采用条状琼脂。

2.3 普通琼脂加血前要彻底消毒

待温度降至48～50℃时，加入采好的羊血，这样既不至于温度太高破坏血成分，也不至于温度太低以至凝固，不能分装。所以控制好温度比较重要。

3 注意控制好培养基的最终pH

（1）细菌在培养基中分裂繁殖除温度、空气、营养条件外，对pH的反应也很敏感。酸碱度不适宜即便营养最丰富的培养基，细菌也不能很好地生长繁殖，或根本不发育。因而制备培养基必须正确测定pH。一般测定法有：①试纸测定法，此法简单方便，但有误差。②比色管测定法，现普遍采用此法。

（2）pH测定最重要的是防止反复加酸加碱，最好一次加妥。因为反复加酸加碱会增加培养基中氯化钠含量，盐含量太高会使渗透压失去平衡而造成细菌的死亡，而且反复加酸加碱易使培养基发生浑浊和沉淀。为避此现象发生，采取加碱量计算的方法防止盲目加碱。可小试1000ml加碱量，从而推算全部加碱量。另外还应注意以下几点：

①标准管必须准确，定期用电比校对。

②被测溶液和培养基的温度不能太高或太低，因为指示剂在培养基内的反应与温度有关。为真实反应培养基的pH值，测时温度应在20～25℃左右近于体温。

③比色管要颜色、厚薄、粗细必须一致。

④加指示剂的吸管和滴管应避免与培养基接触，否则培养基进入指示剂内，造成指示剂反应颜色不准，影响结果。

⑤观察时应在自然光下观察，避免直对着太阳光和灯光。

4 控制好消毒温度

培养基的消毒是否彻底是很关键的，消毒温度和时间是保证培养基质量的重要一环，既要达到灭菌目的，又要保证各种营养成分不受或少受破坏。一般培养基消毒都是116℃，20～30min，而特殊培养基（如糖类培养基、石蕊牛奶培养基等）就有些特殊之处。温度太高会导致糖分解产酸。以前曾多次发生过冲塞、变色等现象，后经几次实践，确定最佳消毒方案即110℃，20min，而且上下磅不能太快，以后很少再出现此类事情。

5 制作消化汤时应注意的事项

消化汤在培养基制作时应用非常普遍，无论是猪胃消化汤还是肉肝胃酶消化汤以及胰酶消化汤，其实质都是酶促反应。因此要想消化彻底，必须掌握影响酶促反应速度的因素。

5.1 温度对酶促反应的影响

酶是蛋白质，消化温度太高会使酶变性失活。酶的最适温度是酶的反应速度达到最高峰的温度，一般最适宜温度为40～50℃，60℃以上即开始变性失活。经多次实践，认为猪胃消化汤最适宜温度为50～53℃，肉肝胃酶消化汤是56～58℃，消化液较清朗、彻底。

5.2 pH对酶促反应的影响

酶的活性受所在环境pH影响，溶液pH不同，酶的活性也不同。在其它条件不变时，酶在一定的pH范围内活性最高，此pH为最适PpH，胃蛋白酶最适pH为1.5～2.5，我们一般控制在1.6～2.0，胰蛋白酶最适pH为7.8～8.4。因而无论搞猪胃消化汤还是肉肝胃酶消化汤都要加盐酸，根据经验，猪胃消化汤按1%加，肉肝胃酶消化汤按1.2～1.3%量加，测pH为1.8～2.0为宜。

5.3 底物浓度对酶促反应的影响

底物浓度与反应速度之间存在一定的函数关系。肉、肝、胃均为底物，因而要控制好底物与水的比例。一般配制猪胃液的比例是：猪胃：蒸馏水＝3：10，如果用于计数或选菌最好是3.5～10。肉肝胃酶消化汤比例为：新鲜牛肉2kg，新鲜猪肝0.5kg蒸馏水10000ml。

5.4 酶浓度对酶促反应的影响

当其他条件相同时，酶促反应速度与酶浓度成正比。肉肝胃酶消化汤中加胃蛋白酶0.4～0.5%。猪胃消化酶大多存在于腺体所分泌的消化液中，不需要另加，如胃质量差可适当加些胃蛋白酶促进消化。

5.5 消化时间

规程规定胃18～24h，视消化而定。一般我们消化22～24h便停止消化，视汤清朗为宜。抽取上清加热煮沸，按2.5～3.0%量加入2N氢氧化钠溶液调pH达3.8左右，停止消化，汤备用。

以上就是培养基在制作时的几个问题，以及影响消化汤消化程度和速度的几个因素。

[1] 王树成.制作培养基过程中应注意的几个问题[J].天津畜牧兽医，1993，（1）：40.

[2] 孔怡，蔚承祥，郑铮.如何提高制作母种培养基的质量[J].食用菌，2009，31（1）：27-28.