HPLC、HPLC-MS在经方成分分析及Co-IP、激光共聚焦在经方药理机制研究中的应用

吴 莹 陈向阳 玄子男 李宇航

(北京中医药大学基础医学院，北京，100029)

经方指《伤寒论》和《金匮要略》所记载之方剂。经方具有用药精当、剂量准确;组方严谨、配伍巧妙;剂型丰富、煎服有法;加减灵活、功效卓著等特点，为历代医家进行方剂研究的首选对象［1］。然而，经方的现代研究同样面临药理作用机制复杂、有效成分不明确等问题，从而制约了经方在现代医学领域的推广以及国际化的进程。因此，凭借现代药学、免疫学及分子生物学等技术手段，从经方主要活性成分的鉴定、药理作用的分子机制等方面揭示经方的作用机制，是经方现代研究的重要关节之一。基于此，我们在本文将介绍高效液相色谱(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)相关技术在经方成分鉴定，以及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、激光共聚焦技术在经方药理作用机制研究方面的应用及思路。

1 HPLC及高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术在经方现代研究中的应用

现代药理学研究需要明确药物成分、含量以及质控。HPLC及其相关技术是以液体作为流动相，采用高压泵、高效固定相、高灵敏度检测器发展而成的一种分离分析方法，由于具有准确快速等优势，常用于检测药物的主要成分及含量，是药物分析研究中关键的质控技术。HPLC凭借其高效、高速、可分离大多数液体样品等优势，已经广泛应用于药物的含量测定［2-3］、成分分析［4-5］、质量控制［6-7］等方面。同时，利用HPLC的高分离效能和质谱技术(MS)的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点，将HPLC与MS联合使用，更加有利于准确分析药物组分［8-9］。HPLC及HPLC-MS联用技术的优越性，使其广泛被应用到经方成分及含量的鉴定中。经方的HPLC、HPLC-MS分析涉及经方样品的前处理、经方成分的定量分析、定性分析以及经方的药物代谢研究等方面。

1.1 经方样品的前处理 经方汤剂是我国应用最早、最广泛的一种剂型，是将加工炮制或未经炮制的药材纳入饮用水(或其他专用水)中浸泡，再经煎煮去渣取汁制成的液体制剂［10］。煎煮法是我国中药复方传统的提取方法，也是现代经方研究过程中最常采用的提取方法。煎煮方法直接影响到药物有效成分的溶出量，不同经方煎煮方式会有所不同，需高度重视。魏惠珍等［11］将大黄36 g，厚朴27 g，枳实27 g，芒硝13.5 g浸泡在8倍量水中30 min，加热煮沸后，文火慢煎40 min，放冷，纱布滤过得大承气汤，用于大承气汤HPLC指纹图谱的研究。胡俊辉［12］称取干姜、黄芩、黄连、人参各75 g，加10倍量的水浸泡2 h后，煎煮1 h，滤过再煎煮两次，合并滤液，浓缩定容至2000 mL作为水煎液;采用RP-HPLC测定干姜黄芩黄连人参水煎液的11种药效成分。

随着科技的发展与科研的需要，许多新技术、新方法如超声提取法、水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法、微波萃取法等被应用到中药化学成分提取中，其中超声提取法也常被用于经方有效成分的提取，尤其在经方丸剂样品溶液制备方面，更显其重要性。如郭琪等［13］精密称取麻仁润肠丸样品0.5 g，加甲醇25 mL，称重，超声(100W，45kHz)30 min，再用甲醇补足重量，摇匀滤过即得麻仁润肠丸供试品溶液。李冬梅等［14］采用超声提取法得止嗽定喘丸溶液，又通过固相萃取技术净化处理样品，用于止嗽定喘丸中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量的测定。

1.2 HPLC及HPLC-MS联用技术在经方成分分析中的应用 经方药物组成变化多样，所含化学成分类型众多，结构复杂，数目庞大。如何将现代化的成分分析手段与现有的提取技术相结合，对于经方有效成分的分离分析至关重要，而HPLC法及HPLCMS可以实现多种成分分离分析，展现出独特的优势。

1.2.1 经方定量分析 由于HPLC具有简便、快速、大大提高检测效率等特点，已在经方研究中占据着重要的地位。HPLC通过定量分析经方的多种化学成分，可确定经方有效成分的含量、分析经方配伍效应、实现经方用药的多指标质量控制，为经方的临床应用提供科学依据。HPLC定量分析结果的可靠性和准确度还可通过标准偏差、日内以及日间精密度来衡量。毛莹等［15］利用 HPLC法，采用色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，3种不同的流动相，4种梯度洗脱方法分别对葛根芩连汤中葛根素、大豆苷、大豆苷元，黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱，甘草酸铵、甘草苷进行了含量测定。尧爱珉等［16］采用HPLC法对栀子大黄汤中的9种特征成分进行定量测定，并分析该经方配伍前后成分的变化。实验建立了HPLC-UV测定该经方水煎液中栀子苷、柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷的含量测定方法，结果显示栀子大黄汤全方配伍能够增加栀子苷及三种黄酮苷的含量;该实验又采用HPLC-DAD法对栀子大黄汤中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚进行含量测定，发现枳实-大黄配伍可以增加五种蒽醌化合物的含量。朱继孝等［17］建立HPLC-DAD法对栀子柏皮汤中栀子苷、甘草苷、西红花苷-I、盐酸药根碱、西红花苷-Ⅱ、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和甘草酸8种有效成分含量的同时测定，为该复方的质量控制与评价提供依据。刘晶晶等［18］采用反相HPLC法对三黄泻心汤中生物碱类、黄酮类、游离蒽醌类、结合蒽醌类等四大类成分共16个药效组分进行了含量测定，为中药药效组分质量评价方法的建立提供了科学依据。

1.2.2 经方定性分析 经方化学成分复杂，其间往往存在着复杂的相互作用关系，这正是经方发挥疗效的基础。通过对经方复杂成分体系中主要成分的定性分析，对于进一步揭示药效物质基础有着重要的意义。HPLC法不仅在有效成分含量测定方面展现了较高分析能力，而且在化学成分定性分析中也占据重要的地位。HPLC法利用样品和对照品比对的方法进行定性分析，方法简单，但必须是已知物，而将HPLC与质谱联用可以克服定性分析时对标准品的依赖，可作为化学成分分析简便准确可靠的方法。采用HPLC-MS可以在线获取样品中各化合物的多级质谱，通过与标准物质的多级质谱图进行比较，或分析对照已知化合物的多级质谱图［19］，可迅速对经方化学成分进行快速分析鉴别。汪航等［20］采用串联质谱技术，分析鉴定出栀子大黄汤中的20个化合物，包括黄酮类、蒽醌类以及环烯醚萜类等。Qin等［21］采用 HPLC-ESI-MS分析方法对百合知母汤中的主要成分进行了鉴定;在正、负离子模式下获得化合物的分子量信息，通过比对文献数据及对照品质谱裂解信息，鉴定出了38个化学成分，包括4个酚酸糖苷、3个黄酮和31个皂苷。

通过将经方有效成分提取液质谱图与组成该方各单味药提取液质谱图相对比，可对各成分的药材来源进行归属。Xu等［22］建立了HPLC-ESI/MS/MS分析了大承气汤组分的分析方法，采用反相C18色谱柱，梯度洗脱，负离子扫描模式，共鉴定出30个化合物;通过与标准品比对，确定了14个化合物，包括2个单宁酸、3个蒽醌、2个番泻苷、5个黄酮、2个木脂素;通过与大黄、枳实、厚朴等单味药提取液的质谱对比，发现单宁酸、蒽醌和番泻苷来源于大黄，黄酮来源于枳实，木脂素来源于厚朴。王海燕等［23］采用HPLC-MS联用技术对不同制法四逆汤中的化学成分进行了定性鉴别，共定性出传统水提液28个化学成分，其中14个化学成分来自黑附子，7个化学成分来自干姜，余下7个化学成分来自炙甘草;有效部位组合液中30个化学成分，其中14个化学成分来自黑附子，8个化学成分来自干姜，8个化学成分来自炙甘草。杨楠等［24］为确定芍药散中镇痛活性部位中2个新化合物的来源，采用HPLC-MS/MS技术，正离子扫描，检测方式为一级质谱扫描，子离子扫描和多反应离子监测，对该经方的6个组分药材分别进行检测，并以2个新化合物为对照品，最终确定二者均来源于白术。

1.3 HPLC及HPLC-MS联用技术在经方药物代谢中的应用 经方是一个的复杂体系，其药效作用并不简单的依赖于复方中已知化学成分产生，也可能来源于代谢产物。药物代谢就是研究药物进入体内后，在体液、酶等的作用下发生生化反应的过程，其研究内容包括代谢物的分离、鉴定、代谢途径的追踪、体内体外代谢的比较以及痕量分析测定［25］。经方本身化学成分的复杂性以及经方药物代谢成分的未知性，对于探明复方中发挥疗效的成分具有一定的挑战性，但是现代分析技术和仪器的发展为经方药物代谢研究提供了有力武器。HPLC及HPLC-MS技术不仅可以定量分析中药复方有效成分及代谢物在体内的含量变化，而且可以定性分析代谢成分。

随着药物代谢动力学研究的不断深入，探明经方有效成分的血清药物浓度与药理作用之间的关系也逐渐成为必不可少的环节。HPLC可实现对不同时间点血液中有效成分的含量测定，进而获得血药浓度;再以血药浓度为指标，采用药动学软件拟合血药浓度-时间曲线，以此来反应中药复方的药动学规律。陈月凤等［26］采用HPLC法建立了大鼠灌胃给予葛根芩连微丸后血浆中葛根素、黄芩苷和小檗碱的浓度变化并绘制出血药浓度-时间曲线，为进一步开展葛根芩连方制剂有效成分的血药浓度与药理作用提供参考依据。高宇勤等［27］采用HPLC技术测定当归四逆汤中肉桂酸和甘草酸在大鼠血清中的变化，并利用3P97软件计算这2种化合物的药代动力学参数，发现肉桂酸和甘草酸吸收都比较快，但前者代谢较快，在体内滞留时间短。该课题组又研究了当归四逆汤中阿魏酸在大鼠血清中的含量变化;采用HPLC方法，通过外标法测定其血药浓度，发现大鼠口服当归四逆汤后，阿魏酸吸收较快，但是消除慢［28］。

HPLC-MS具有速度快、选择性强、检测限低以及高定性能力等优点，已然是经方药物代谢研究的理想工具。徐卫东等［29］采用HPLC-MS/MS法，对大鼠灌胃给予四逆散后血清中有效成分进行定性鉴别;结果共鉴定出芍药苷、柚皮素、甘草苷、橙皮苷、橙皮素、甘草酸、柴胡皂苷d等7个原型成分，同时还检测出甘草次酸、柚皮素葡萄糖醛酸、橙皮素葡萄糖醛酸等代谢产物。

总之，运用现代分析技术开展经方药物研究，对于经方药效物质基础的发现、揭示经方配伍效应、阐明经方的作用机制，指导临床规范化应用具有重要的意义。HPLC法应用于经方化学成分的分离分析，既简便又准确可靠，而且将HPLC的高分辨能力与质谱的强定性能力相结合，可以获得更多的化合物含量和结构信息。HPLC-MS对难以辨别的痕量化合物依然拥有较高的定性定量分析能力，其在今后的经方研究中的地位必将大大提升。

2 免疫共沉淀及激光共聚焦技术在经方现代药理学研究中的应用

在经方的药理作用机制研究方面，常用的方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫法等可用于检测可溶性蛋白的浓度、western blot用于半定量检测蛋白、PCR及荧光定量PCR检测DNA及mRNA水平、免疫组化检测蛋白在组织或细胞中的分布。以上方法分别在基因及蛋白表达水平检测经方对于信号通路关键分子及目的蛋白的影响以明确经方的作用机制。然而，经方的成分复杂，且基于中医“整体观”的理论基础，其药理作用机制有“多靶点”“整体调节”的特点。因此，其作用特点可能不仅局限于对某个、某几个蛋白的影响，而体现在对蛋白与蛋白之间、蛋白与核酸之间作用的影响。基于此，越来越多的中医药研究者开始重视免疫共沉淀技术在经方药理作用研究中的应用。同时，大量研究表明，经方的药理作用可能表现在对关键分子的细胞内定位、转移的影响，因此，激光共聚焦技术也被广泛地应用于经方的药理机制研究中。笔者将结合课题组的研究，介绍免疫共沉淀及激光共聚焦技术在经方现代药理研究中的应用。

2.1 免疫共沉淀技术在经方药理机制研究中的应用 免疫共沉淀技术是一门以抗原和抗体特异性结合为基础发展起来的研究目的蛋白和与其结合的大分子物质相互作用的技术。该技术主要用于蛋白质鉴定，还可应用于RNA和DNA鉴定等。该技术主要研究的是自然状态下的蛋白质间相互作用，作用对象为天然蛋白，前提需要已知目的蛋白。主要操作步骤分为细胞裂解，标签蛋白与目的蛋白结合，形成蛋白质复合体，清洗，洗脱，分离蛋白。

目前常用蛋白检测技术如Western blotting、免疫组化技术，主要针对某种特定蛋白，分析目标过于局限，脱离了整体环境，而免疫共沉淀则针对蛋白质复合物，侧重于大分子物质与蛋白质之间的相互作用，不再局限于一个单独的靶点，通过捕获复合物分析蛋白质调控的过程。目前主要应用于肿瘤研究、酶与病毒研究、信号转导通路研究和寄生虫研究等［30-31］。根据大分子物质不同，分为:

1)蛋白质-蛋白质复合物，这是最常见的免疫共沉淀，分离复合物后，联合WB实验，对目标蛋白进行验证，如利用免疫共沉淀技术验证 SET与eEF1A1在人肝细胞内的相互作用，推断SET蛋白可能在三氯乙烯致癌的作用机制中起着重要作用［32］。

2)DNA-蛋白质复合物，又称为染色质免疫共沉淀，分离复合物得到的DNA序列分别通过PCR技术、测序分析和芯片技术等进行序列分析，如通过免疫共沉淀验证细胞内HIF-1与Id-1启动子的结合部位［33］。

3)RNA-蛋白质复合物，分离复合物后RNA序列验证方法同DNA类似，如免疫共沉淀与基因芯片技术联合建立一种RNA 5’端帽子结构的鉴定方法［34］。另一方面，免疫共沉淀技术不仅可以验证某种复合物的存在，还可以发现新的结合物质或作用方式，如运用免疫沉淀联合质谱筛选肝核因子HNF3β相互作用蛋白质，寻找生理水平下新的蛋白复合体［35］。

中药药理学主要研究中药作用于机体的机制和机体对于药物的代谢。目前中药复方(包括经方)的作用机制成为中药药理学的研究热点，而其在机体作用过程复杂，特点为多靶点、多成分、多途径。如果仅仅运用WB和免疫组化技术，已满足不了中药药理机制的研究，免疫共沉淀技术如今已逐步运用于中药复方分子机制的研究，如研究调心方对动物阿尔茨海默病相关tau蛋白磷酸化的调节及其可能的作用机制，利用免疫共沉淀验证早老蛋白-1与其靶点tau蛋白的结合，确定两种蛋白的确相互作用［36］。同时，免疫共沉淀与芯片技术联合，作为一种高通量研究技术，恰恰为经方复方分子机制研究提供了可行的方法。

当然，免疫共沉淀技术仍有其局限性，一方面检测的是蛋白质粗体物，验证两种蛋白质之间的相互作用不能确定为直接作用，另一方面，实验具有一定的冒险性，用于免疫共沉淀的抗体选择要慎重，以免出现假阳性，或无反应。

2.2 激光共聚焦技术在经方药理机制研究中的应用 激光共聚焦技术是利用激光束透过照明针孔形成点光源对标本焦平面上的每一点进行扫描，被照射点在探测针孔出成像，通过光电倍增管或冷电耦器件接收，迅速在电脑屏幕上成像。由于照明针孔和探测针孔对于被照射点是共轭的，焦平面上的点可以同时在照明针孔和探测针孔处成像，焦平面以外的点不会成像。该技术克服了普通光学显微镜检测时被检测点收到附近相邻点的干扰的缺点，可以形成清楚地光学横断面，图像准确清晰，能进行实时监测，同时结合Z轴扫描还能做出三维成像。

激光共聚焦常常用于蛋白质检测，为了提高分辨率和获得高对比度图像，一般需先使用带有特殊荧光标记的抗体孵育染色，再冲洗后进行激光共聚焦检测。如有需要，可以进行活体染色，还可同时直接进行两色，甚至三色染色，当然，多色染色时需注意选取荧光波长差别较大的染料。笔者的课题中，曾对细胞中F-actin、细胞膜和ERM蛋白同时进行染色，从而分析经方对病毒感染的细胞中F-actin与ERM蛋白在细胞中分布的影响［37］。而免疫组化法无法观察正常生理状态下的组织形态，且进行复染时常常会引起颜色覆盖，或颜色交叉后变色等问题。另一方面，共聚焦技术不仅可以对蛋白质进行定位监测，如分析目标蛋白在细胞或组织中的分布，通过检测角蛋白和波形蛋白的表达可以进行滋养细胞的鉴定［38］，还可借助图片分析软件选取显色部位面积求和，或统计荧光强度，进行定量检测，同时兼顾了免疫组化与WB实验的优点;不仅可以应用于体内试验，对组织进行染色，还可应用于体外实验进行细胞染色。激光共聚焦技术不仅可以检测蛋白质，还可实时测定细胞内游离Ca2+、pH值及其他细胞内离子［39］。张丽萍等研究加味温胆汤对抑郁型大鼠海马神经细胞内钙离子浓度的影响，采用激光共聚焦技术检测Ca2+浓度变化情况，发现加味温胆汤可能通过抑制海马神经细胞钙离子大量内流，发挥其抗抑郁效应［40］。

激光共聚焦目前已应用于中药组织化学研究，如对白芷根中香豆素类成分的定位和定量研究［41］，还应用于中药药效学和药理学研究，如用于中药与天然药物诱导肿瘤细胞凋亡的研究，观察细胞核变化与凋亡小体、观察线粒体膜电位变化、观测活性氧自由基含量等，或对抗菌中药成分进行机制研究［42］。其应用前景并不仅仅局限于上述方向，利用其实时监测功能，可以将其运用于药物代谢动力学，或者用于分析药物结构与功能的关系。

3 讨论

综上所述，免疫共沉淀技术可用于研究经方对蛋白之间相互作用的影响，激光共聚焦技术可观察经方不同蛋白、离子的分布、转位及含量的影响，结合常规核酸、蛋白定量技术以及免疫共沉淀、激光共聚焦可较为全面地分析经方对细胞内信号途径的影响，从而分析经方药理作用的分子机制;HPLC及HPLC-MS是目前最常用的药理成分分析及质量控制的技术，同样适用于经方成分的鉴定及分析，在经方药理机制研究基础上结合经方主要活性成分的分析，可使经方的临床应用得到国内外同行的认可，有利于经方的推广和应用。

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