马尾松内生真菌的分离鉴定及多样性1)

邓慧华

(龙岩市林业科学研究所，龙岩，364000)

植物内生真菌泛指那些在其生活史中的某一阶段或在整个生活史中都生活在植物组织内部，但并没有引起植物组织明显病害症状的一类真菌［1-2］。其普遍存在于各种植物体内，分布在植物根、茎、叶等器官表皮下的组织中，与宿主植物在长期演化中互惠互利，共同生长［3］。近些年来，前人进行了很多关于内生真菌的研究［4-5］，内生真菌应用价值逐渐引起人们的重视。

马尾松(Pinus massoniana)是我国松属树种中分布最广的重要用材树种，富含松脂，是中国主要的产脂树种。有关马尾松内生真菌的研究鲜见报道。笔者曾对马尾松内生真菌产油脂菌株及其产油脂效果进行研究［6-7］。笔者对马尾松进行内生真菌的分离纯化，通过形态学鉴定确定马尾松内生真菌的种类及其在各组织中的分布，并分析马尾松内生真菌的生物多样性，为丰富马尾松内生真菌资源提供依据，为马尾松内生真菌的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

马尾松样品来源:马尾松样品采自福建省漳平五一国有林场。采样时挑选生长性状良好、无病虫害症状的健康植株，分根、茎、叶进行采集。根、茎采集10 cm 以上的条段，样品从植株分离后，用沾水的棉花包住伤断处，装于密封的塑料袋中，带回实验室于冷藏箱中低温保鲜备用。

培养基的配方及制作:PDA 固体培养基，马铃薯200 g，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30 min，4层纱布过滤。加入葡萄糖20 g，琼脂18 ～20 g，继续加热搅拌混匀，补足水分定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。

内生真菌的分离:采用组织块法分离内生真菌［8-9］。将马尾松根、茎和叶分别剪成3 ～5 cm 的小段，用蒸馏水冲洗干净后，无菌条件下用75%乙醇表面消毒2～5 min，再将样品放人0．1%的升汞溶液中进一步消毒10～30 s，最后用无菌水冲洗3 次。用无菌吸水纸吸干表面水分，用刀片将根和茎切成0．3～0．5 cm2小块，将叶切成0．3 cm 的小段，接入PDA 培养基平板上，置于培养箱中27 ℃避光培养3～7 d。

内生真菌的纯化:采用菌丝顶端纯化法［10-11］，待组织块周围长出菌丝，挑取尖端部分转接至新的PDA 培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上，逐步纯化获得纯培养。将分离纯化后的菌株接种于固体斜面PDA 培养基上，对菌株进行编号，保存备用［12］。

菌种鉴定:主要根据宏观的菌落特征、微观的个体特征及一些生物学特性，对分离到的马尾松内生真菌进行形态学分类［13］。挑取纯化的真菌菌丝，接种于PDA 培养基上，采用3 点接种法培养，肉眼观察菌落正反面特征;采用点植法或载玻片培养法等制成玻片，置于光学显微镜下观察菌种在培养过程中菌丝形态、个体发育、产孢结构及孢子形态等特征，参照《真菌鉴定手册》［14］及有关资料对其进行鉴定，确定真菌的分类学地位。

2 结果与分析

2．1 马尾松内生真菌的分离鉴定及多样性

经表面消毒和分离纯化，从采集的马尾松根、茎、叶样品中共分离到102 株内生真菌，经过形态学观察和鉴定，初步将其鉴定为11 个属，分属于6 科6 目4 纲3 门。其种类组成及菌落形态特征见表1。由表1 可以看出，分离到的马尾松内生真菌中毛霉属(Mucor)属于接合菌亚门(Zygomycotina)，生赤壳属(Bionectria)属于子囊菌门(Ascomycota)，其余9个属归属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，分别分属于丝孢纲(Hyphomycetes)和腔孢纲(Coelomycetes)。其中丝孢纲(Hyphomycetes)最多，包括丛梗孢目(Moniliales)、丛梗孢科(Moniliaceae)的木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、丛梗孢属(Monilia)、曲霉属(Aspergillus);丝孢目(Hyphomycetales)、丝孢科(Hyphomycetaceae)的拟青霉属(Paecilomyces);瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)的镰刀菌属(Fusarium)，共6个属;腔孢纲(Coelomycetes)3 个属，为球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaeropsidaceae)的茎点霉属(Phoma)、拟茎点霉属(Phomopsis)和叶点霉属(Phyllosticta)。

表1 马尾松内生真菌的形态特征

2．2 马尾松不同器官上的内生真菌的分布

内生真菌在马尾松不同器官组织的菌株数量和涉及属的数目情况见表2。

表2 马尾松不同器官内生真菌菌株数量

马尾松内生真菌在根、茎、叶中均有分布。从马尾松的根部分离到12 株内生真菌，占总菌株数的11．76%，涉及6 个属，占总属数的54．55%;从茎部分离到23 株内生真菌，占总菌株数的22．55%，涉及9个属，占总属数的81．82%;从叶部分离到67 株内生真菌，占总菌株数的65．69%，涉及11 个属，占总属数的100%。结果表明，从叶部分离到的内生真菌数量和涉及属的数目最多，茎部次之，从根部分离到的内生真菌数量和涉及属的数目均为最少。

马尾松内生真菌在不同器官的种群分布情况见表3。在分离出的102 株马尾松内生真菌中，毛霉属30 株，占总菌株数的29．41%，在根、茎、叶中的分布分别为4、6、20 株;木霉属24 株，占总菌株数的23．53%，在根、茎、叶中的分布分别为3、8、13 株。毛霉属和木霉属为马尾松内生真菌中的优势属。曲霉属11 株，占总菌株数的10．78%，在根、茎、叶中的分布分别为2、2、11 株;拟茎点霉属9 株，占总菌株数的8．82%，在根、茎、叶中的分布分别为1、0、8 株;茎点霉属8 株，占总菌株数的7．84%，在根、茎、叶中的分布分别为0、2、6 株;青霉属5 株，占总菌株数的4．90%，在根、茎、叶中的分布分别为0、2、6 株。曲霉属、拟茎点霉属、茎点霉属和青霉属是马尾松内生真菌中的优势属。其余属菌株数相对较少，为非优势属。

表3 马尾松不同器官内生真菌的种群分布情况

从表3 可以看出，分离出的马尾松内生真菌11个属中，毛霉属、木霉属、青霉属、曲霉属在根、茎、叶中均有分布;丛梗孢属、拟青霉属、茎点霉属、生赤壳属、叶点霉属在茎和叶部有分布，在根部无分布;镰刀菌属、拟茎点霉属在根和叶部有分布，在茎部无分布。各个属在叶部的分布均为最多。

3 讨论

对马尾松的根、茎、叶部内生真菌的分离鉴定和多样性分析表明，马尾松内生真菌的种类具有多样性，在不同器官上的种群和数量分布也具有丰富的多样性，但不同器官的内生真菌在数量和种群分布上都存在较大差异。由叶分离出的内生真菌株数和属的数量都高于根和茎部分。这与其他树种内生真菌的相关研究结果存在差异［15］。宋萍等［16］对雷公藤(Tripterygium wilfordii)植物内生真菌进行分离，从植株枝中分离到的菌株数量高于根和叶;高智辉等［17］从从核桃(Juglans regia)的根、茎、叶内分离到的内生真菌为茎部最多，叶部次之，根部最少;窦学娥［18］进行桑树内生真菌分离，结果根部分离到的内生真菌数量最多，茎部次之，叶部最少。马尾松内生真菌分离过程中，由于根和茎的横切面会分泌较多油脂，阻碍了根和茎组织块与PDA 培养基的接触，接入培养基平板后，油脂在平板表面的散布也不利于内生真菌的生长，所以根和茎部分离出的内生真菌数量较少。其中根部分离的数量最少，这也可能是由于根系分泌物影响了根际微生物的生长。所分离的植物内生真菌的数量和种类还与取样时间、植物种类、气候条件、生长年限、分离方法、生长环境、取样数量等因素有关。本研究的马尾松样品采自“国家级马尾松重点林木良种基地”福建省漳平五一国有林场，分离到的内生真菌具有典型性和代表性。如何解决马尾松根、茎横切面油脂分泌对内生真菌分离的影响有待进一步探讨。

不同器官内生真菌的分布存在差异，可能是由于不同器官组织的结构或者所含化学成分不同，所以入侵、生长的内生真菌不同［19］。内生真菌的侵染机理有待进一步研究，以更好地掌握内生真菌种群分布多样性的规律，丰富内生真菌资源。

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