血清浓度对小鼠骨髓干细胞生物特征的影响

郝艳红，李 敏，杨 军

血清浓度对小鼠骨髓干细胞生物特征的影响

郝艳红1，李 敏1，杨 军2

目的 研究不同血清浓度处理对小鼠骨髓干细胞生物特性的影响。方法 小鼠全骨髓培养法培养细胞，原代细胞用10%、15%、20%血清体积分数的培养基，观察细胞形态及增殖情况。结果 细胞在血清浓度为10%的培养基中增殖速度快，细胞形态以梭型为主；血清浓度为20%时细胞胞体面积增大，且增殖速度减慢。结论 体外培养小鼠骨髓干细胞的最佳血清体积分数为10%。

骨髓基质细胞；体外培养；生长特征

骨髓间充质干细胞是一类来源于中胚层的成体干细胞，在特定诱导条件下，具有向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等不同细胞分化的能力。小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在骨髓中仅占0.001%～0.01%，与人、大鼠和兔MSCs相比，MSCs的培养相对比较难。有文献报道，不同的换液时间、血清浓度、氧浓度及培养基类型、细胞接种浓度等对小鼠MSCs体外培养都产生影响[1]。本实验探讨最佳小鼠MSCs体外培养的最佳血清浓度，从而为小鼠骨髓干细胞体外培养奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 试剂和仪器：DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS， Gibc)，垂直洁净工作台(SW-CJ-1F)， Olmyplus倒置相差显微镜(CKX41)，低速台式大容量离心机(TDL-50B)，恒温培养箱(HH·CP-7)。实验动物：4周龄昆明小鼠16只，体质量18～25 g。

1.2 方法

1.2.1 骨髓基质细胞的取材及细胞悬液制备 4周龄昆明小鼠，颈椎脱臼处死，于75%乙醇中浸泡5 min，超净工作台内分离股骨、胫骨，剪去干骺端，PBS冲洗骨髓腔至发白。细胞悬液1 500 r/min离心20 min，弃上清，再用PBS清洗1次。加入无血清培养基，轻轻吹打，制成单细胞悬液，用血球计数板计数，调整细胞密度至3×105/mL。

1.2.2 培养条件 将MSCs悬液接种于20 mL玻璃培养瓶中，加入血清，调整血清浓度至10%、15%、20%，37℃、5%CO2、95%湿度条件下常规培养。3 d后首次全量更换培养液，每3 d更换培养基。

1.2.3 MSCs增殖及生长状态的观察 倒置显微镜下观察不同浓度血清条件下细胞的贴壁情况、细胞形态及达80%融合所需要的时间。

1.2.4 细菌污染鉴定 连续培养30 d，取细胞培养瓶内培养基2 mL进行革兰氏染色，菌鉴。

2 结果

2.1 MSCs形态及贴壁情况 MSCs接种24 h后，细胞开始贴壁，呈圆形。48 h后呈梭形生长的细胞数量明显增多，偶见胞体有多个突起的细胞。72 h换液后，细胞分散或聚集生长，细胞形态的变化以长梭形为主。96 h后分散生长细胞减少或消失，细胞多呈漩涡状或放射状层叠交织生长，无接触抑制。接种7 d后，梭形细胞逐渐被多角形细胞代替，个别细胞呈长条索状，且可见细长胞体中出现黑色颗粒，立体感减弱，怀疑细胞老化。MSCs整体生长趋势是基质细胞的铺壁面积越来越大。

2.2 不同浓度血清对MSCs增殖的影响 10%、15%两组MSCs生长状况较20%组好，首次换液后细胞总数及梭形细胞数均高于20%组。9 d后10%、15%组细胞增殖至80%，达到传代要求，高倍镜下观察细胞立体感强，20%组细胞增殖不足50%，且高倍镜下胞质中见黑色颗粒。随着时间的延长，未传代的10%、15%两组于13 d后细胞体扩展，生出毛刺装突起，呈老化状态，失去增殖能力。

2.3 MSCs污染鉴定 连续培养30 d后，可见培养瓶内部底面出现黑色颗粒，经鉴定，未见污染，可能是细胞老化所致。

3 讨论

人骨髓基质细胞在基因治疗、细胞治疗、组织工程等方面应用前景广阔，通过干细胞移植，可以治疗脑缺血、脊髓损伤、骨损伤等。但骨髓中BMSCs 含量稀少，要进行体外的相关研究，需进行体外纯化和扩增。本实验采用不同的血清浓度培养细胞，发现最佳的血清浓度是10%～15%组，20%组细胞增殖较慢且细胞发生分化，这与文献报道的较高的血清体积分数可能提高培养液的渗透压使细胞难以适应一致[2]。细胞密集区域表现为放射状，随着时间的延长，相互重叠成多层，这为钙化组织提供了必不可少的三维结构[3]。

本研究还发现培养时间过长，细胞胞体增大老化或呈长条型，不利于增殖，这可能与细胞的单层培养有关，有文献报道单层培养细胞增殖速度较快，短期内细胞表型不会变化，但随着传代次数的增多，细胞会逐渐失去特有的表型，发生分化现象。如关节软骨细胞体外培养后渐呈梭形，合成和分泌Ⅱ型胶原、蛋白多糖的能力减少，具有成纤维细胞的特征[4]。因此，应选用生长状态较好的1～2代细胞进行试验[5]。抗生素常用来预防细胞培养过程中的污染，如青链霉素、庆大霉素等。有研究报道青链霉素在100～500 U/mL范围内能促进人脐带血干细胞的增殖，降低凋亡，但大量使用会降低脐带血干细胞的归巢和黏附能力[6]。本实验在未使用青链霉素的条件下，严格按照无菌操作，连续培养同一细胞30 d，经鉴定未见细菌污染。

[1] 施镇江,黄桂琴,王廷华,等.血清量及首次换液时间对荧光小鼠骨髓基质细胞体外增值的影响[J].四川大学学报:医学版, 2005, 36(4):566-570.

[2] 王改琴,杜小丽,吴宏.细胞密度和血清对小鼠骨髓基质细胞体外生长的影响[J].重庆医科大学学报,2007,32(11):1178-1181.

[3] 徐忠世,杨述华,肖德明,等.兔骨髓基质细胞的体外培养及鉴定[J].南方医科大学学报, 2007:27(4) :550-552.

[4] 胡春江,徐宏光.细胞培养方式与力学刺激[J].黑龙江医药科学,2010,33(6):19-20.

[5] 张坡,黄岚,蒋世忠,等.小鼠骨髓基质细胞参与缺血组织血管再生及时相关系[J].中国临床康复,2005,9(3):143-145.

[6] 李昆,于秋艳,金玉楠,等.细胞培养中枯草杆菌污染的防控[J].现代预防医学,2007, 34(11):2140-2141.

Growth Characteristics of Murine Bone Marrow Stromal Cells underDifferent Cell Culture Densities in Vitro

HAO Yan-hong,LI Min,YANG Jun

(Xinyang Vocational and Teachnical College,Xinyang 464000,China)

ObjectiveTo study the effect of different cell culture densities on growth of mice bone marrow stromal cell in vitro.MethodsBone marrow stromal cells were cultured in DMEM containing 10%,15% and 20% FBS respectively. The amplification of MSCs was determined.ResultsThe cultured cells were proliferated well in DMEM containing 10% FBS. Spindle cells were observed when the adhered cells nearly to fuse to monolayer. The cytoplasm was magnifying, and the cells proliferation was lower.ConclusionThe appropriate concentration of FBS is 10% for bone marrow stromal cell in vitro culture.

bone marrow stromal cells；in vitro culture；growth

河南省科技发展计划(科技厅)(082102310044)

2015-01-19

1.信阳职业技术学院，河南信阳 464000 2.信阳职业技术学院附属医院，河南信阳 464000

郝艳红(1982-)，女，河南郑州人，讲师，从事预防医学教学工作。

杨军，男，副主任医师，E-mail：Sunday0914@126.com

R34

A

1672-688X(2015)01-0019-02