外源性一氧化碳抗大鼠肢体缺血再灌注所致心肌损伤的实验研究

李婧 杨香敏 宋巧 卢海丽 陈娜 史万英

再灌注严重的缺血肢体后，该肢体的损伤反而会加重，甚至引发其他远隔器官的损伤，该现象为缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤，心肌是对缺血较为敏感的组织之一。肢体IR过程产生的大量活性氧物质和炎性介质，进而使中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)在心大量扣押，这是肢体IR后心肌损伤发生的中心环节。血红素氧合酶-1(HO-1)是近来发现的一种可被氧化应激和炎性反应所激活、并对机体具有保护作用的热休克蛋白，其催化产物一氧化碳(CO)具有抗炎性、抗氧化损伤等重要功效。本文主要研究外源性CO对于肢体IR所致缺血肢体的作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验中，22只8个月大SD雄性大鼠(清洁级)，体重220～250 g，由河北省实验动物中心提供(动物许可证号，冀504085)，随机分3组，2只为假手术组(S组);10只为IR组;10只为IR吸入CO组(RC组)。

1.2 方法 隔离暴露3组右后肢股动脉根部，采用无创血管夹交紧，并把创口进行缝合，用止血带绑扎右后肢根部，造成大鼠肢体缺血。实验4 h后，除去血管夹和橡皮筋，并灌注48 h，以复制大鼠肢体IR模型。手术后4 h开始进行RC组，让大鼠持续吸入含有CO(500 ppm)的医用空气4 h，每间隔12 h后再吸入4 h，连续进行3次，共12 h;IR组和S组均在正常空气中呼吸。实验后，逐一检查各心肌组织学及横纹改变情况，应用流式细胞仪检测肌组织中Bax、Bcl-2及凋亡百分比的值;应用全自动生化分析仪检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)和血清乳酸脱氢酶(LDH)表达的变化。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件，计量资料以±s表示，采用方差分析和q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外源性CO对心肌组织学的影响 S组心肌细胞形态正常。IR组心肌细胞胞体增大，部分肌细胞变性、甚至坏死;肌浆溶解、被破坏，胞核消失，呈空泡状;闰盘结构不清;胞间有大量的中性粒细胞浸润，且广泛出血。RC组肌组织损伤显著减轻，可见部分肌细胞变性，肌浆含有空泡，呈灶状溶解，大部分肌细胞肿大程度减轻。见图1、2。

图1 外源性CO对大鼠肢体IR致心肌组织结构的影响(HE×400)

图2 外源性CO对大鼠肢体IR致缺血肢体肌组织横断面结构的影响(HE×400)

图3 外源性CO对大鼠肢体IR致心肌组织横纹的影响(横纹肌染色×400)

2.2 外源性CO对心肌横纹的影响 S组心肌肌纤维形态正常。IR组肌纤维变性、坏死，心肌横纹结构不清，紊乱，部分消失。RC组肌形态基本正常，横纹明显，仅见局灶性横纹排列紊乱。见图3。

2.3 外源性CO对血清LDH、CK-MB的影响 RC组血清LDH值、CK-MB值明显低于IR组(P＜0.05)。见表1。

2.4 外源性CO对心肌细胞凋亡百分比、Bax及Bcl-2表达的影响 IR组和RC组比较，心肌促凋亡蛋白Bax的FI值、心肌抗凋亡蛋白Bcl-2的FI值和心肌细胞凋亡百分比差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 外源性CO对大鼠肢体IR致心肌组织中凋亡百分比、Bax、Bcl-2以及血清LDH、CK-MB水平的影响±s

表1 外源性CO对大鼠肢体IR致心肌组织中凋亡百分比、Bax、Bcl-2以及血清LDH、CK-MB水平的影响±s

注:与 S组比较，*P ＜0.05;与 IR组比较，#P ＜0.05

组别 凋亡百分比(%) Bax Bcl-2 LDH(U/L) CK-MB(U/L)S组(n=2)16.8 ±5.9 1.00 ±0.02 1.00 ±0.16 177 ±57 39 ±17 IR 组(n=10) 30.0 ±2.7* 1.06 ±0.04 1.06 ±0.03* 1 189 ±247* 274 ±77*RC 组(n=10) 22.0 ±2.0*# 1.01 ±0.05# 1.12 ±0.05# 876 ±184*# 204±63*#

3 讨论

研究表明，动物肢体IR后吸入适量的外源性CO，对肢体IR所导致的脑、肝、肾等器官损伤具有一定防治作用［1］。

IR损伤是全身性病理过程，涉及身体的多个因素。身体器官长时间缺血后，组成细胞呼吸链断裂、能量代谢产生障碍;进行再灌注后，缺血的该器官会产生及释放氧自由基和致炎物质等很多有害因子［2］。该有害物质作用于血液成分及血管内皮后，PMN、EC被大量刺激而激活。表达炎性因子、细胞黏附分子，引起PMN的贴壁、黏附、积聚、移出及释放反应，最终引发全身性炎性损伤［3］。聚集于心肌组织的中性粒细胞和释放的大量毒性物质是肢体IR所致心肌损伤的中心环节。

医学研究发现，信使分子CO具有抗炎、抗氧化及抗细胞凋亡等生物效应［4］。机体在受到重创、休克及氧化应激损伤等病理状态情况下，机体自身会产生更多 CO［5］。Cepinskas等［6］证实，CO 能够下调粘附分子ICAM-1的表达、抑制PMN的扣押。CO可以阻断炎性介质的形成过程，抑制白细胞、血小板的集聚和IL-18介导的炎性反应［7］，并能够抑制超氧化物的产生及溶酶体的释放。以上研究从不同侧面证明，CO是通过多途径、多位点发挥其信使分子的作用。据此分析，主动调高内源性CO的表达水平，可能是救治IR损伤的一种较为理想办法。但是，调高内源性CO的表达水平，需要一段较长时间的诱生过程，因此及时给予适量的外源性CO，可能比诱导内源性CO表达更有使用价值。

当动物机体的肌细胞膜结构完整性受到损伤时，LDH、CK可渗透出肌细胞进入血液循环，进而引起机体损伤。本实验结果表明，吸入适量CO可增加心肌细胞膜的稳定性，进而保护组织。

组织细胞遭受IR损伤时的重要病理改变为细胞异常凋亡。Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2为抑凋亡蛋白。本实验结果表明，肢体IR后部分心肌细胞启动了凋亡程序，吸入外源性低浓度CO能有效阻止心肌细胞凋亡。

IR损伤时，血管内皮损伤，PMN移出、释放，血管渗出，间质水肿，组织细胞能量代谢障碍，细胞肿胀、变性、凋亡及坏死。本结果显示肢体IR所致心肌损伤时心肌内中性粒细胞浸润程度明显加重，给动物吸入低浓度CO可使浸润程度减轻，提示CO抗肢体IR致心肌损伤的作用与其抑制中性粒细胞浸润有关。本研究结果表明在对受挤压伤、断肢再植术等患者的救治中，使患者适量吸入低浓度CO，可有效减轻心肌的IR损伤。本研究对于其他炎性疾病均极具潜在的临床应用价值。

1 史中立，凌亦凌，姚玉霞，等.大鼠肢体缺血再灌注后肾内HO-1表达的变化及意义.中国病理生理杂志，2004，20:371-374.

2 Chatterjee PK.Novel pharmacological approaches to the treatment of renal ischemia-reperfusion injury:a comprehensive review.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2007，376:1-43.

3 Chin BY，Jiang G，Wegiel B，et al.Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization by carbon monoxide results in cytoprotective preconditioning.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:5109-5114.

4 Liu SH，Xu XR，Ma K，et al.Protection of carbon monoxide inhalation on lipopolysaccharide-induced multiple organ injury in rats.Chin Med Sci，2007，22:169-176.

5 Harder Y，Amon M，Schramm R，et al.Ischemia-Induced Up-Regulation of Heme Oxygenase-1 Protects from Apoptotic Cell Death and Tissue Necrosis.Surg Res，2008，17:109-113.

6 Cepinskas G，Katada K，Bihari A，et al.Carbon monoxide liberated from carbon monoxide-releasing molecule CORM-2 attenuates inflammation in the liver of septic mice.Am J Phvsiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294:G184-191.

7 Zabalqoitia M，Colston JT，Reddy SV，et al.Carbon monoxide donors or heme oxygenase-1(HO-1)overexpression blocks interleukin-18-mediated NF-kappaB-PTEN-dependent human cardiac endothelial cell death.Free Radic Biol Med，2008，44:284-298.