颅脑创伤后挫伤灶边缘水肿区皮层脑组织miRNA-21表达及预后相关性研究

刘 华，王文明，杨 鉴，任光辉

微小核糖核酸(mioro ribanucleic acid，miRNA) 是一类长度为20～24个核苷酸的小的内源性非编码调控RNA，通过靶向结合信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3’非翻译区(3’-UTR)导致mRNA的降解或翻译抑制［1-2］，从而调控靶基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程。目前已发现的miRNA约有700多种，miRNA-21是其中一个重要的miRNA分子。研究［3］表明miRNA-21在创伤后脑组织中表达明显变化，提示miRNA-21可能与颅脑创伤关系密切。但迄今有关miRNA-21在颅脑创伤预后方面的研究却鲜有报道。本研究回顾性分析江苏大学附属昆山医院122例颅脑创伤患者的临床资料，并对上述患者脑组织标本进行miRNA-21表达检测，分析生存期与该基因表达之间的关系，试图探讨miRNA-21作为颅脑创伤预后分子标志的可能性。

临床资料

1 标本来源

收集江苏大学附属昆山医院2011年12月～2013年12月期间手术切除颞叶挫伤灶边缘水肿区皮层脑组织的石蜡标本122例，且对患者的临床资料进行分析。其中男性99例，女性23例;年龄17～84岁，平均(42．19±14．33)岁。入院时格拉斯哥昏迷评分(GCS)4～13分，平均(7．85±2．60)分。颅脑创伤类型:单纯性脑挫裂伤42例，急性硬膜下血肿伴脑挫裂伤48例，急性脑内血肿伴脑挫裂伤32例，不包括单纯性硬膜外及硬膜下血肿。全部患者均排除心、肝、肾等重要脏器疾病。手术前后的治疗方法均按照颅脑创伤临床救治指南要求执行［4-5］。本研究经江苏大学附属昆山医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

2 主要试剂及仪器

高速冷冻离心机;NanoDropND-1000紫外分光度计(Nano Drop公司，美国);7300实时聚合酶链反应(PCR)系统(Applied Biosystems公司，美国)、9700 Thermocycler反应仪(Applied Biosystems，美国);Recover All总核酸提取试剂盒(Applied Biosystems公司，美国);hsa-miRNA-21引物、内参RNU6B引物(RiboBio公司，中国);Real-time逆转录试剂盒(RR037A，TakaRa公司，日本);SYBR®Select Master Mix试剂盒(Applied Biosystems公司，美国)。

3 实时定量PCR方法

3.1 总RNA提取 利用Recover All总核酸提取试剂盒提取脑石蜡组织总RNA，严格遵照说明书进行各操作步骤。总RNA用50μL二乙基焦磷酰胺(DEPC)水稀释，储存于-80℃备用。采用Nano-DropND-1000紫外分光度计测量总RNA光密度(OD)260/280。

3.2 逆转录反应 按照逆转录试剂盒操作程序进行逆转录反应，RNA的量为0．5μg，冰上加入下列试剂:总RNA 1μL，5×PrimeScript缓冲液5mL，PrimeScript RT逆转录酶混合Ⅰ1μL，茎环状逆转录引物2μL，DEPC水，总体积20μL。所有试剂加入后，42℃反应15min、85℃反应5s、4℃反应15min，后置-80℃保存备用。

3.3 实时定量PCR 实时定量PCR反应体系如下:SYBR®Green Realtime PCR Master Mix 10μL，上游引物(5μM)1μL，下游引物(5μM)1μL，互补脱氧核糖核酸(cDNA)2μL，加DEPC水至20μL。将反应管置7300 Real-time PCR反应仪中，反应条件为95℃预变性10min后，按下述条件扩增40个循环:95℃15s，60℃1min。实验重复3次。

4 分组

miRNA-21相 对 表 达 量 采 用2-△△Ct方 法［6］，△△Ct=△Ct-Avg(Ct表示循环数，Avg表示均值)。△Ct=(CtmiRNA-21-CtU6)-Avg(CtmiRNA-21-CtU6)。把2-△△Ct中位数作为分界值，将患者分为miRNA-21低表达组和高表达组。

5 随访

所有患者均伤后随访6个月，以格拉斯哥预后评分(GOS)评价治疗效果，其中1分(死亡)、2分(重度残疾)和3分(中度残疾)者为预后不良，4分(轻度残疾)和5分(良好)为预后良好。

6 统计学方法

miRNA-21表达与临床参数统计方法采用χ2检验;采用Kaplan-Meier方法进行生存分析，并采用Log-rank检验比较两组生存率;采用Cox风险比例模型进行各个协变量的联合效应分析。应用SPSS 19．0统计软件进行统计学处理。P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 miRNA-21表达与颅脑创伤患者临床资料

根据miRNA-21的表达，颅脑创伤患者被分为高表达和低表达组。122例颅脑创伤组织中，61例miRNA-21相对高表达。统计结果显示，miRNA-21的表达量与患者预后相关(χ2=4．006，P=0．045)。miRNA-21的表达量与年龄、性别、入院时GCS评分、致伤原因及颅脑创伤类型均无统计学意义(P＞0．05)(表1)。

2 miRNA-21表达与颅脑创伤患者生存时间的关系

利用Kaplan-Meier对122例患者进行生存分析，结果显示:miRNA-21高表达组患者中位生存时间159d，较miRNA-21低表达组患者(平均126d)明显延长，两组生存期差异有统计学意义(Log-rank检验:χ2=9．723;P=0．002)(图1)。Cox风险比例模型单因素分析显示:入院时GCS评分［风险比(HR)=1．761;P=0．035］和miRNA-21表达情况(HR=1．347;P=0．027)与颅脑创伤患者预后相关(表2)。根据Cox回归模型多因素分析的结果，入院时GCS评分(HR=1．915;P=0．031)和miRNA-21表达情况(HR=1．535;P=0．025)是颅脑创伤患者预后的独立危险因素(表2)。

表1 miRNA-21表达与颅脑创伤患者临床参数的关系

表2 颅脑创伤患者生存期单因素及多因素Cox回归分析

图1 不同miRNA-21表达水平颅脑创伤患者的生存分析

讨 论

近年来，随着颅脑创伤救治指南的实施和完善，脑创伤患者的预后有了很大改善，但重度颅脑创伤的病死率及致残率仍较高［7］。因此，详细了解其机制对诊断、治疗和改善预后必不可少。有实验研究［8］表明，脑创伤后大鼠皮层脑组织中存在大量miRNA表达，其中伤后24h 2倍以上差异表达的27个;伤后48h 2倍以上差异表达的27个;伤后72h 2倍以上差异表达的24个，提示miRNA可能参与了颅脑创伤的发病机制和病理过程。同时多项研究表明miRNA-21在颅脑创伤后显著高表达［3，9］。本研究回顾分析122例颅脑创伤患者的临床资料，并采用实时PCR方法对上述患者挫伤脑组织标本中miRNA-21的表达水平进行检测，以期为在分子水平对颅脑创伤预后进行干预提供理论参考。

miRNA是一类非编码小分子RNA，可通过特异性降解mRNA或抑制蛋白翻译从而调控靶基因表达，参与细胞生长发育、分化凋亡等重要的生命进程［10］。近期研究表明，miRNA-21在颅脑创伤后皮层脑组织、海马组织、齿状回等多个区域中表达显著上调，且该研究还通过miRanda，TargetScan和PicTar三种预测检索工具确认出程序性细胞死亡4(PDCD4)、T-lymphom侵袭转移基因(Tiam1)、Peli-1基金、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)、多梳蛋白4(CBX4)、FASLG基因、白介素12A(IL12A)、同源框同源1基因(MSX1)、NTF3基因和肿瘤坏死因子受体相关因子499(TRAF499)等共99种在3’-UTR含有miRNA-21结合位点的潜在靶基因［9］，提示miRNA-21在颅脑创伤演变过程中或扮演重要角色。此外，Truettner等［11］研究发现，早期亚低温治疗可通过一类体温敏感性miRNA(miRNA-874和miRNA-451等)所涉及的细胞活动，改善脑创伤大鼠的预后。

本研究发现122例颅脑创伤患者的临床资料中，miRNA-21表达与年龄、性别、入院时GCS评分、受伤机制及颅脑创伤类型均无明显相关，卡方结果提示miRNA-21表达与患者预后相关。Cox单变量和多变量分析也进一步显示总生存期与miRNA-21表达有关，miRNA-21在创伤后皮层脑组织中的表达程度与患者预后关系密切。而生存分析提示miRNA-21表达与患者总生存期呈正相关，即miRNA-21表达水平高的患者生存时间较长。以上结果表明miRNA-21可能是判断颅脑创伤预后的一个重要指标。

综上所述，miRNA-21高表达提示颅脑创伤预后良好，miRNA-21可作为颅脑创伤预后的一个重要分子标志，未来值得进一步开展严格的前瞻性临床研究进一步证实该结果的可靠性。

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