小鹅瘟病毒实验室检测方法研究进展

庄金秋+梅建国+莫玲+姚春阳+沈志强

中图分类号：S858.335.3      文献标识码：A      文章编号：1673-1085（2014）05-0040-05

小鹅瘟（Gosling plague，GP）又称为鹅细小病毒病，是由细小病毒科细小病毒属的鹅细小病毒 （Goose parvovirus，GPV）引起的一种急性或亚急性、高度接触性、败血性传染病。该病主要以严重下痢、渗出性肠炎和肠道栓塞为特征。发病雏鹅常表现为出血性、纤维素性及渗出性肠炎，最后形成肠内栓塞。该病主要发生于1月龄以内雏鹅和雏番鸭，具有传播快、发病率和死亡率高的特点，死亡率可高达90%以上。随着雏鹅日龄的增长，其发病率和死亡率呈下降趋势。我国学者方定一于1956年首次报道该病，并成功分离到GPV。该病长期以来在我国乃至全世界鹅群中广泛流行，是目前危害养鹅业的主要传染病之一，常给养鹅业造成严重的经济损失。一般认为，小鹅瘟根据流行病学、临床特征和剖检特点，可以做出初步诊断，但是确诊本病需要进行实验室诊断。本病暴发的主要原因是呈亚临床感染或隐性感染者的鹅排毒污染种蛋及环境，从而将病毒传给易感雏鹅。因此，做好该病的预防控制，特别是快速而准确的诊断方法的建立受到国内外学者的广泛关注。本文就我国在GPV检测技术研究进展方面作一综述，以期对小鹅瘟的深入研究和疾病防控提供参考。

1  病毒分离鉴定

GPV能在鹅胚、番鸭胚或其原代细胞培养物以及Marc-145细胞中增殖并形成细胞病变（CPE），但不能在PK15和CEF等细胞中生长。将病料接种在未长满单层的鹅胚或番鸭胚原代细胞培养物中，随着传代次数的增加，细胞单层感染病毒后3～5d出现明显CPE，表现为细胞折光性增强、圆缩直至溶解脱落等。将细胞培养物经苏木素-伊红染色后可见CowdryA型核内包涵体与合胞体的存在[1]。将收集的死亡鹅胚、番鸭胚尿囊液或细胞培养物经磷钨酸负染后进行电镜观察，根据病毒大小、形态等典型的细小病毒特征可进行鉴定。

2  血清学检测

2.1  酶联免疫吸附试验（ELISA）  朱少璇等[2]（1989）应用抗GPV单抗对鹅胚初次分离毒用间接ELISA法进行鉴定。李永峰[3]（2010）以纯化的GPV重组VP3蛋白为包被抗原，建立了检测雏番鸭水禽细小病毒抗体的间接ELISA方法，经初步应用于血清中水禽细小病毒抗体的检测，其敏感性高于琼脂扩散试验，与中和试验结果基本一致，符合率为84%。尚绪增等[4]（2010）也建立了检测GPV的间接ELISA方法，表达了GPV重组NS2蛋白。秦爱建等[5]（1990）建立了GPV单抗免疫酶斑点试验，对提纯GPV最小检出病毒蛋白量为0.17ng/ml。李新华[6]（1998）应用辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗对GPV强毒致死的雏鹅和番鸭的组织匀浆上清液进行了斑点酶联免疫吸附试验，其敏感度达到8.5ng/ml，检测时间3h，非常适用于大批量样品的快速检测。廖德惠等[7]（1994）用纯化的GPV抗原，制备兔抗GPV血清，应用斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）能检出少至4.883ng/mg的GPV抗原。龚建森等[8]（2008）建立了双抗体夹心ELISA方法检测GPV。布日额等[9]（2009）利用 GPV VP1～VP3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原，建立了检测鹅抗体的ELISA和Dot-ELISA方法，并对弱毒疫苗的免疫效果进行了检测，两种方法的检测结果基本一致。杜秋明等[10]（2011）建立了检测GPV的单抗双夹心ELISA方法，对GPV检测灵敏度达0.312mg/L。用该法对延边某养鹅场疑似发生小鹅瘟病的252只病死鹅进行检测，结果阳性率为75.79%，与病毒中和试验方法的检测结果符合率达91.11%，为GPV的检测和区域流行病学调查提供了一种简便快速的血清学方法。三种ELISA方法进行比较发现，能够直接检测病料的是斑点酶联免疫吸附，而间接ELISA和双抗体夹心ELISA检测需要对病毒进行分离，病毒分离至少需要5d，有的甚至初次分离不出病毒，需要连续传代2～3次，试验时间较长，不能满足临床快速诊断小鹅瘟的需要。邹叔和等[11]（1992）报道了用生物素-亲和素（ABC）系统的复合物-酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）检测GPV的研究，其对提纯的GPV DNA最小检出量为0.1g，该方法很敏感，但操作繁琐且复杂。

2.2  琼脂免疫扩散试验（AGP）  AGP方法操作简便、经典快速，适于基层推广和应用，但灵敏度不高，需要高效价抗血清及多倍浓缩的尿囊液进行GPV的检测。李侯宝等[12]（1987）、余永建等[13]（1987）、洪锋等[14]（1989）、王新海[15]（1990）、秦爱建等[16]（1993）、汤明等[17]（1994）、霍峰等[18]（2000）先后报道了应用AGP检测GPV的研究。陈天祥[19]（1990）报道了应用该方法检测GPV卵黄抗体水平的研究。AGP方法非常适用于GPV感染的临床诊断及免疫鹅抗体水平的监测。

2.3  反向间接血凝试验  徐为燕等[20]（1981）、孙怀昌等[21]（1989）建立了反向间接血凝试验的方法检测鹅胚尿囊液中的GPV。郭玉璞等[22]（1994）对此法做了进一步完善，对病料中GPV的检测灵敏度能达到24ng/ml。人工感染的鹅胚尿囊液、人工感染发病鹅肝组织及其粪样中的GPV检出率分别为100%、81%和99%。该方法对小鹅瘟可疑病例3h内即可做出诊断，有很好的实用价值，但敏感性差，易受到非特异性因素的影响，降低试验的准确性。

2.4  胶乳凝集试验（LAP）  朱小丽等[23]（2012）采用GPV单抗标记聚苯乙烯胶乳，建立了检测GPV抗原的LPA方法。对人工感染病例的LPA检测结果与PCR符合率为93.3%;对临床18份疑似GPV病例进行检测，LPA和PCR符合率为94.5%。表明LPA具有简便、快速、特异、准确等优点，适用于基层快速诊断小鹅瘟病。

2.5  病毒中和试验（VN）  GPV与相应的抗体结合后，会失去对易感鹅的致病力。此方法可在鹅胚及其成纤维细胞上进行。赵坤等[24]（2000）、张耀成等[25]（2001）以鹅胚及其成纤维细胞建立此法检测GPV抗原，结果不仅重复性好，敏感性高，还易于操作，但检测时间较长，不适于大量病料组织的快速检测。

2.6  免疫荧光（IF）抗体技术  潘玉民等[26]（1990）应用GPV高免鹅血清提取IgG标记异硫氰酸荧光素（FITC）建立直接免疫荧光法用于检测鹅体内的GPV抗原，该方法可直接检出病料组织中的GPV，但不能克服番鸭细小病毒（MPV）与GPV在血清学上的交叉性。邱平等[27]（1996）也有报道应用FITC标记抗鹅源GPV的特异性单抗，建立免疫荧光技术检测鹅源GPV，该方法敏感性好，检出率较高，2h内可检测出GPV抗原。郑大恒等[28]（2003）用兔抗GPV高免血清，提取IgG标记FITC建立直接免疫荧光法用于检测鹅体内的GPV抗原，该方法虽然简便快捷，但仍不能区分MPV和GPV。朱小丽等[29]（2012）将抗番鸭GPV单抗腹水采用透析法标记FITC，制备成抗GPV荧光抗体，研制了检测GPV抗原的直接免疫荧光方法。蔡羲等[30]（2009）用抗番鸭GPV杂交瘤细胞上清和单抗作为一抗，检测GPV取得良好的效果。吕雪峰等[31]（2012）利用制备的荧光抗体，建立了较为高效的检测GPV的直接免疫荧光法，表明其所制备出的鹅IgG荧光抗体敏感性较高、特异性较强。郭卉等[32]（2013）建立了检测GPV的间接免疫荧光方法（IFA），该方法不仅能够检测鹅胚成纤维细胞中的GPV，还能够检测发病鹅组织冰冻切片中的GPV。为今后GPV细胞活疫苗的检测评价和临床诊断提供了技术手段。免疫荧光抗体技术重复性和稳定性良好，具有较强的特异性和敏感性，而且操作简便、快速，但需要特殊的仪器，不适合基层推广。

2.7  胶体金免疫层析（GICA）技术  该方法是基于单克隆抗体建立的诊断技术。李长瑜等[33]（2007）报道了GPV胶体金层析检测卡的研究，虽然该方法的特异性强，灵敏度高，但是该方法需要对病原进行分离后，取鹅胚或者番鸭胚尿囊液或细胞培养物进行检测，病原分离和检测至少需要5d，不适合在临床上快速检测应用。

2.8  对流免疫电泳技术  谢曼琳等[34]（1990）建立了检测GPV的对流免疫电泳试验方法，对GPV的检出率高达94.1%，整个过程只需3h，比AGP快4倍，有利于小鹅瘟的早期确诊。本方法虽然具有快速、敏感、特异性强等特点，但容易受到非特异性因素的影响，降低试验结果的准确性。

3  分子生物学检测

3.1  PCR技术  目前我国多家研究机构均建立了GPV的PCR快速检测方法，在临床小鹅瘟病例的诊断中取得了良好的效果。布日额等[35]（2003）、胡桂学等[36]（2003）、黄诚等[37]（2004）、姚笛等[38]（2006）、李福伟等[39]（2006）、刘家森等[40]（2007）、邵洪泽等[41]（2009）、李文学等[42]（2010）、王倩等[43]（2012）、赵磊等[44]（2013）建立了检测GPV的单重PCR方法，赵研等[45]（2007）、王暖成等[46]（2010）、王静雅[47]（2012）建立了双重套式PCR方法。董浩等[48]（2011）建立了能对石蜡切片中GPV核酸进行定位的原位PCR方法，为GPV在鹅体内的定位、致病机理研究等提供有效的试验手段。荧光定量PCR方法检测GPV具有更高的特异性和敏感性。毕建敏等[49]（2008）将Real-time PCR成功应用于GPV的检测。龙朕等[50]（2010）、董浩等[51]（2011）建立了GPV的Taq Man荧光定量PCR检测方法。饶桂波[52]（2013）研究建立的PCR-DHPLC检测方法阳性检出率达100%，是一种新的检测GPV的方法。该方法能够特异性检测病料组织中GPV，为临床GPV的感染提供了有效的检测手段。

3.2  环介导等温扩增（LAMP）技术  尚毅等[53]（2011）、金文杰等[54]（2012）建立了LAMP技术应用于GPV的快速诊断，缩短了检测时间。傅秋玲等[55]（2013）针对GPV VP3基因的8个位点设计了6条特异性引物，也建立了快速检测GPV的LAMP方法。该方法灵敏、特异、实用、快速，非常适合基层及现场快速检测。研究首次采用钙黄绿素代替SYBR Green染料作为GPV LAMP检测方法的指示剂，解决了采用SYBR Green染料作为指示剂造成假阳性的技术难题，使得LAMP方法在临床检验上具有更广阔的应用前景，为临床检测提供了一种新方法。

3.3  核酸探针技术  核酸探针技术是一种极其敏感的分子生物学方法，具有pg水平的检测灵敏度。该方法检测GPV不仅仅快速、准确、操作简便、成本低，还可反复长期使用，从根本上减少甚至避免了抗原的多样性和易变性而引起的交叉反应和非特异性反应。段玉友等[56]（1993）、余兵等[57]（2002）、布日额等[58，59]（2004和2005）以地高辛标记成核酸探针，并运用该探针初步建立了检测病料中GPV核酸的斑点杂交法。该方法特异性、敏感性和适用性都很强，但其技术性要求较强，操作繁琐，且检测成本较高，不适宜临床上的推广与应用。

4  存在的问题与展望

小鹅瘟是危害养禽业的重要传染病，一旦发病将造成巨大的经济损失。因此，建立快速、敏感、特异的GPV检测方法，加强该病的流行监测，掌握该病的流行趋势及该病毒分子遗传变异的规律，是该病临床诊断、防疫与检疫的迫切要求，将有助于降低该病在家禽的流行，并促进研制有效防控该病的疫苗。目前针对该病毒已建立了多种检测方法，这些方法的使用极大地方便了该病的及早诊断，使得疫情得以有效控制。然而这些方法各自存在不同的优缺点或苛刻要求，如有的存在操作繁琐、受检测材料限制，有的试验周期较长，有的对试验仪器及检测人员技术要求高等，这就需要实验室检测人员根据各自条件，综合选择并建立合适的检测方法，及时、准确、快速地监测疾病的发生、发展和流行，并提供有效的防控措施。另外，随着分子生物学的发展和人们对GPV研究的不断深入，相信不久的将来，更多更为高效、敏感、特异、快速、简易而且价廉的检测方法将会被建立起来。

参考文献：

[1]  Kontrimavichus LM，Makogon VR and Navrotkii VV. Epidemiological， clinical and pathological features of goose viral enteritis[J]. Vet Moscow，1980，7：34-35.

[2]  朱少璇，董国雄.抗小鹅瘟病毒单克隆抗体及其在防治上的初步应用[J].江苏农学院学报，1989，10（3）：41-44.

[3]  李永峰.鹅和番鸭细小病毒VP3-ELISA诊断方法的建立[D]. 中国农业科学院，2010，1-8.

[4]  尚绪增，张雅为，王兆鹏，等.鹅细小病毒NS2蛋白间接ELISA方法的建立[J].中国预防兽医学报，2010，32（8）：595-598.

[5]  秦爱建，周阳生.免疫酶斑点法快速检测小鹅瘟病毒[J].中国兽医科技，1990，（7）：28-29.

[6]  李新华.应用斑点酶联免疫吸附试验快速诊断小鹅瘟的研究[J].中国兽医科技，1998，（1）：21-22.

[7]  廖德惠，谢镜怀.斑点酶联免疫吸附试验检测小鹅瘟病毒的研究[J].四川畜牧兽医，1994，（3）：5-6.

[8]  龚建森，刘帧亚，黄永良，等.双抗夹心ELISA检测小鹅瘟病毒的研究[J].湖北畜牧兽医，2008，（10）：21-22.

[9]  布日额，王君伟，吴金花.检测小鹅瘟感染抗体的Dot-ELISA方法研究[J].中国生物工程杂志，2009，29（9）：68-70.

[10]  杜秋明，鲁承，王暖成，等.鹅细小病毒单抗双夹心ELISA检测方法的建立[J].中国兽医学报，2011，31（3）：319-322.

[11]  邹叔和，李心坦，周建强，等.ABC-ELISA检测小鹅瘟的研究[J].中国动物检疫，1992，9（3）：6-7.

[12]  李侯宝，王永坤.琼脂扩散试验对小鹅瘟病毒检测的研究[J].畜牧与兽医，1987，（4）：148-149.

[13]  余永建，胡世君，黄伟，等.利用琼脂免疫扩散试验检测小鹅瘟病毒抗原及抗体的研究[J].畜牧与兽医，1987，（5）：202-204.

[14]  洪锋，黄引贤.用微量免疫扩散试验检测小鹅瘟和鸭瘟的研究[J].中国畜禽传染病，1989（4）：15-18.

[15]  王新海.小鹅瘟琼脂扩散试验的研究[J].中国动物检疫，1990，（4）：11-13.

[16]  秦爱建，王永坤，周阳生，等.免疫酶琼脂扩散试验在小鹅瘟诊断中的应用[J].中国畜禽传染病，1993，（1）：30-31.

[17]  汤明，摩德惠，谢镜怀.应用改良琼脂免疫扩散试验检测小鹅瘟病毒的研究[J].中国兽医杂志，1994，20（8）：7-8.

[18]  霍峰，慧观涛.应用琼脂扩散法检测小鹅瘟抗原抗体[J].中国兽医杂志，2000，20（2）：21-22.

[19]  陈天祥.用琼扩试验对鹅卵内小鹅瘟抗体定量检测的初步摸索[J].中国兽药杂志，1990，（3）：31-32.

[20]  徐为燕，周阳生.小鹅瘟病毒反向间接血球凝集实验的初步报告[J].畜牧兽医学报，1981，（1）：23.

[21]  孙怀昌，李俊宝，朱少漩，等.用抗小鹅瘟病毒单抗IgG建立反向间接血凝试验的研究[J].中国畜禽传染病，1989，（2）：44-46.

[22]  郭玉璞.家畜传染病诊断与防治[M].北京农业大学出版社，1994.

[23]  朱小丽，陈少莺，林锋强，等.应用胶乳凝集技术诊断番鸭小鹅瘟病[J].中国预防兽医学报，2012，34（9）：715-718.

[24]  赵坤，张慧辉.鹅细小病毒感染的诊断与治疗[J].  动物科学与动物医学，2000，（2）：44.

[25]  张耀成，李东政，梁盛冒.60日龄肉鹤发生小鹅瘟的诊治[J].中国动物检疫，2001，（2）：33.

[26]  潘玉民，董玉平，石全瑞，等.小鹅瘟免疫荧光诊断方法的研究[J].中国兽医科技，1990，（4）：6-8.

[27]  邱平，沈素芳，周晓倩，等.直接荧光法快速诊断小鹅瘟病毒[J].中国家禽，1996，（3）：30-31.

[28]  郑大恒，李永明，温贵兰，等.小鹅瘟病毒荧光抗体的制备与应用[J].中国兽医科技，2003，23（11）：33-35.

[29]  朱小丽，陈少莺，程晓霞，等.番鸭小鹅瘟病直接荧光诊断试剂的研制[J].畜牧兽医杂志，2012，31（4）：1-3.

[30]  蔡羲，高春亮，朱小丽，等.应用间接免疫荧光法快速检测番鸭小鹅瘟病毒[C]. 福建省畜牧兽学会2009年学术年会论文集，2009：86-88.

[31]  吕雪峰，李忠勋，李志慧，等.小鹅瘟免疫荧光抗体的制备及检测方法研究[J].中国动物保健，2012，14（2）：13-15.

[32]  郭卉，涂飞，吕亚楠，等.抗鹅细小病毒单克隆抗体的制备及其免疫荧光检测方法的建立[J].中国动物传染病学报，2013，21（4）：1-6.

[33]  李长瑜，周铁忠，张喜悦，等.小鹅瘟病毒胶体金层析检测卡的研究[J].中国预防兽医学报，2007，29（8）：625-628.

[34]  谢曼琳，何月英.用对流免疫电泳快速检测小鹅瘟病毒[J].养禽与禽病防治，1993，（2）：43.

[35]  布日额，王君伟，吴金花，等.应用PCR技术检测鹅细小病毒[J].畜牧与兽医，2003，35（6）：8-10.

[36]  胡桂学，逢博，高凤山，等.小鹅瘟PCR诊断方法的建立和初步应用[J].经济动物学报，2003，7（2）：50-53.

[37]  黄诚，程安春，汪铭书，等.鹅细小病毒强毒PCR诊断方法[J].中国兽医科技，2004，34（9）：54-60.

[38]  姚笛，张勇，朱战波，等.应用PCR方法检测鹅细小病毒感染[J]. 黑龙江八一农垦大学学报，2006，18（3）：64-67.

[39]  李福伟，张贵红，吴玄光.小鹅瘟的PCR诊断方法的建立[J]. 黑龙江畜牧兽医，2004，（6）：37-39.

[40]  刘家森，姜骞，司昌德，等.番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立[J].中国兽医科学，2007，37（6）：469-472.

[41]  邵洪泽，李琳，毛文智，等.鹅细小病毒PCR检测方法的建立及应用[J].吉林畜牧兽医，2009，30（5）：5-7.

[42]  李文学，鲁承，王暖成，等.小鹅瘟病毒PCR诊断方法的建立及初步应用[J].黑龙江畜牧兽医，2010，（8）：115-116.

[43]  王倩，鞠环宇，荆志强，等.鹅细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用[J].东北农业大学学报，43（3）;58-62.

[44]  赵磊，吴章青，龚争，等.快速诊断小鹅瘟PCR方法的优化建立[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集，2013，951-953.

[45]  赵妍，王君伟，邢明伟，等.二重PCR检测鸭瘟病毒和鹅细小病毒的初步研究[J].中国预防兽医学报，2007，29（9）：710-713.

[46]  王暖成，鲁承，杜鑫，等.小鹅瘟套式PCR诊断方法的建立及初步应用[J]. 畜牧与兽医，2010，42（2）：79-81.

[47]  王静雅.小鹅瘟病毒检测方法的建立及初步应用[D].南京农业大学，2012，21-28.

[48]  董浩，马磊，单晓枫，等.原位PCR检测雏鹅体内鹅细小病毒方法的建立及其应用[J].中国兽医杂志，2011，47（12）：10-12.

[49]  毕建敏，田夫林，李延鹏，等.荧光定量PCR检测雏鹅人工感染鹅细小病毒后病毒在体内分布规律[J]. 中国预防兽医学报，2008，30（1）：64-67.

[50]  龙朕，林颖，张桐源，等.小鹅瘟病毒荧光PCR检测方法的建立[J].现代畜牧兽医，2010，（5）：51-54.

[51]  董浩，徐楠楠.鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽药杂志2011，45（9）： 12-14.

[52]  饶桂波.鹅细小病毒的分离鉴定及PCR-DHPLC检测方法的建立与初步应用[D].吉林农业大学，2013，28-37.

[53]  尚毅，董嘉文，孙敏华，等.鹅细小病毒LAMP快速检测方法的建立[J].华南农业大学学报，2011，32（1）：98-107.

[54]  金文杰，秦爱建，钟蕾，等.小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法LAMP专利[P].中国发明专利，CN101591713，2009-5-25.

[55]  傅秋玲，施少华，万春和，等.检测鹅细小病毒环介导等温扩增方法的建立及结果判定方法改进[J].福建农业学报，2013，28（1）：9-13.

[56]  段玉友，崔治中，王永坤.鹅细小病毒核酸探针的制备及应用[J].中国畜禽传染病，1993，（5）：37-39.

[57]  余兵.应用核酸斑点杂交法检测鹅细小病毒（GPV）[J].中国兽医学报，2002，22 （5）：453-454.

[58]  布日额，王君伟，吴金花，等.应用地高辛标记核酸探针检测鹅细小病毒的研究[J].畜牧与兽医，2004，35（1）：102-105.

[59]  布日额，王君伟，吴金花，等.鹅细小病毒VP1-VP3非重叠序列的高辛探针的制备和应用[J].中国兽医杂志，2005，41（1）：7-10.