鸭疫里默氏杆菌大罐发酵培养条件优化及验证

王艳+苗立中+付强+庄金秋+沈志强

摘要：为进一步了解鸭疫里默氏杆菌的生长特性，本研究利用改良酵母肉汤培养基运用正交设计的方法，在10L的小型发酵罐中对鸭疫里默氏杆菌各种发酵条件进行了优化。随后将优化结果在GMP生产车间，利用200L大型发酵罐规模化试生产3批鸭疫里默氏杆菌抗原进行验证，结果显示，鸭疫里默氏杆菌活菌数比优化前提高30%，为鸭疫里默氏杆菌产业化奠定了基础。

关键词：鸭疫里默氏杆菌;发酵条件;大罐发酵

中图分类号：S858.325.1+2      文献标识码：B      文章编号：1673-1085（2014）05-0036-04

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer RA）感染是全世界养鸭业的一种主要疾病。该病以病鸭死亡率高、消瘦、胴体淘汰、品质下降等造成巨大经济损失[1]。迄今为止，该病的防治主要有药物防治及疫苗接种两种方法[2]，作为预防鸭疫里默氏杆菌病的有效措施，疫苗正在得到广泛的应用[3]。在疫苗的制备过程中，菌体的浓度直接关系到疫苗质量的好坏和免疫保护效果。所以改善RA的培养条件，提高有效成分浓度对制苗非常重要。高密度发酵作为近年来新兴产业，可有效提高抗原产量和培养基的利用率，大幅度降低生产成本，显著缩短生产周期，减少劳动强度，提高生产效率[4]，为鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的生产提供了一种新的有效可行的抗原制备工艺。本研究旨在通过鸭疫里默氏杆菌发酵培养条件优化达到菌液浓度最大化的目的，为研制高效疫苗打好基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验用菌株  菌株来源：鸭疫里默氏杆菌JX-2株，血清Ⅱ型，分离自北京金星鸭场病死鸭，并由山东绿都生物科技公司菌种室保存。

1.1.2  发酵培养基  改良酵母肉汤：大豆蛋白胨5g，水解乳蛋白8g，20%酵母浸液50ml，氯化钠1.5g，猪胃消化液100ml，加蒸馏水至1000ml;116℃高压灭菌20min，使用前加入5%马血清。

1.1.3  主要仪器和试剂  SBA-40E型双光束紫外分光光度计（Cecil）;GUJS-10C型和GUJS-200C型发酵罐（镇江东方生物）;SHZ-82A型气浴恒温振荡器（江苏金坛中大）;消泡剂;豆油。

1.2  方法

1.2.1  菌种复苏  取冻干保存的鸭疫里默氏杆菌JX-2株，用2ml马丁肉汤稀释、混匀，接种于改良酵母肉汤中，37℃振荡培养18～24h，取样划线接种于改良酵母固体培养基平板，置厌氧罐中，37℃培养18～24h，再挑选符合标准的典型菌落用改良酵母固体培养基进行纯培养。

1.2.2  发酵细菌种子液的制备  用改良酵母肉汤洗下纯培养菌落，按2%种子量接种于120ml改良酵母肉汤培养基中，37℃振荡培养18～24h，经纯粹检验合格后，4℃保存备用。

1.2.3  高密度发酵工艺优化试验方案设计

1.2.3.1  正交试验  运用正交试验设计[4]的方法，将影响鸭疫里默氏杆菌发酵的条件分为通气（L/S.L）、转速（转/min）、培养基pH值等，并将各条件分别设置3个水平，具体试验分组见表1。

1.2.3.2  发酵  上述分组试验均在37℃条件下，培养基为改良酵母肉汤，分别按照上述试验条件各自发酵，发酵罐采用10L容量，发酵液为6000ml，分别采集发酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的发酵液，进行活菌计数及OD450nm值检测。

1.2.4  优化配方和优化工艺在GMP生产车间规模化生产应用  根据培养基配方优化和发酵工艺优化结果，在GMP生产车间规模化发酵生产3批鸭疫里默氏杆菌抗原，发酵罐采用200L，发酵液体积为150L，分别采集发酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h和26h发酵液，进行活菌计数和OD450nm值检测，查看规模化应用效果。

1.2.5  发酵液检测

1.2.5.1  活菌计数  按中华人民共和国兽药典2010年版三部进行。即将发酵不同时间样品分别进行10-1～10-10系列稀释，然后取合适的稀释度接种改良酵母琼脂平板，每个稀释度接种3个平板，0.1ml/板，置蜡烛罐中，37℃培养24h，进行菌落计数，3个平板上菌落的平均数即为该稀释度的细菌数，再乘以稀释倍数即为该菌液的细菌浓度。

1.2.5.2  OD450nm值测定  取不同发酵时间样品，应用紫外分光光度计对其OD450nm值进行测定，并记录数据以进行比较。

2  结果

2.1  RA JX-2株在发酵不同时间各组CFU测定结果见表2。以108CFU为纵坐标，生长时间为横坐标，分别绘出RA JX-2株在发酵不同时间的生长曲线（见图1）。

由表2及图1可见，正交试验组别序号2获得的菌液活菌数最高，在发酵18h可达2.87×1010cfu/ml。此组发酵条件是通气0.1L/S.L;转速150r/min;培养基pH值7.4。

2.2  RA JX-2株在发酵不同时间各组OD450nm值测定结果见表3。以OD450nm值为纵坐标，生长时间为横坐标，分别绘出RA JX-2株在发酵不同时间的OD450nm值变化曲线（见图2）。

由表3及图2可见，正交试验组别序号2获得的菌液浓度最高，在发酵22h，OD450nm值可达6.37，测定结果与菌液活菌数测定结果相一致。

2.3  RA JX-2株在发酵不同时间各批次活菌数及OD450nm值测定结果见表4。分别以活菌数及OD450nm值为纵坐标，生长时间为横坐标，绘出RA JX-2株在发酵不同时间的生长曲线（见图3、图4）。

从表4、图3、图4可见，20130803批次取得的菌液浓度及活菌数目最高，分别为6.47、2.96x1010cfu/ml，20130801批次和20130802批次取得的菌液浓度及活菌数目分别为6.34、2.92x1010cfu/ml和6.43、2.83x1010cfu/ml。

3  分析与讨论

3.1  利用高密度发酵培养的方式，RA在18h时菌液活菌数达到高峰，较摇床培养到达菌数高峰时间要提前6个小时左右，且活菌数也提高了60%多[5]，由此可见高密度发酵培养的优越性。

3.2  从GMP生产车间规模化发酵生产3批鸭疫里默氏杆菌抗原的菌液浓度及活菌数目来看，3批发酵检测数值非常稳定，兽用生物制品GMP车间利用优化的培养基配方和发酵工艺大规模发酵鸭疫里默氏杆菌的效果和实验室试验结果基本相同，可以大规模推广应用。

3.3  根据培养基配方优化和发酵工艺优化结果，在GMP生产车间规模化发酵生产3批鸭疫里默氏杆菌抗原活菌数均达到了280亿/ml以上，而优化之前活菌数最高是200亿/ml，优化后比优化前提高了约30%，这大大节约了生产成本。

3.4  在高密度发酵过程中，我们采用活菌计数及OD450nm值测定2种方法进行培养菌液的菌液浓度测定，以此来确立2种检测方法的相关性，在以后的生产中可通过测定RA发酵液的OD450nm值来推算其活菌数，这样不但可以避免活菌计数的繁琐操作，且可更加及时地得知培养结果，大大提高了生产效率。

3.5  本研究通过提高发酵工艺，优化其工艺参数，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的生产率，不仅可以减少培养体积，还可以缩短生产周期、提高设备利用率从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。这对工业化发酵生产鸭疫里默氏杆菌抗原提供了理论依据并具有一定实用价值。

参考文献：

[1]  Y.M.Saif.禽病学[M].第十二版，北京：中国农业出版社，2012，893-901.

[2]  蔡家利，苏小运，唐晓丽，等.鸭传染性浆膜炎灭活疫苗比较研究[J]. 中国预防兽医学报，2001，23（4）：270-273.

[3]  宁玲忠，雷红宇，胡仕凤，等.鸭疫里默氏菌病研究进展[J].湖南畜牧兽医，2013，175（3）：4-5.

[4]  刘吉山.鸭疫里默氏菌2型制苗菌株的筛选及高密度发酵[D].中国农业大学，2006，1-2.

[5]  苗立中.副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法建立及其分离株高密度发酵研究[D].吉林大学，2012，46-47.