近红外荧光扫描用共聚焦光学系统设计

罗刚银，王弼陡，缪 鹏，王 磊，田浩然，钱 庆，王钟周

(中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，中国科学院生物医学检验技术重点实验室，江苏 苏州215163)

1 引言

荧光标记技术是指利用一些能发射荧光的物质(如荧光探针，荧光染料等)共价结合或物理吸附在所要研究样本的某个基团(如蛋白分子、核酸片段等)上，然后利用荧光显微镜或者荧光扫描仪等仪器检测其荧光特性来提供被研究对象的内部结构信息(如抗原抗体分布、浓度等)。

用于荧光标记的荧光物质有很多，如异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、菁染料等。这些荧光染料的激发波长分布范围从紫外、可见到近红外光谱区，而其发射波长分布范围从可见到近红外光谱区。其中，近红外荧光染料(near infrared fluorescence，NIR)的发射波长为700～1200nm，在该范围内生物分子自身荧光较弱，可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度;近红外荧光具有较强的穿透能力，能够实现样本的深层检测;近红外荧光对样本造成的光损伤较低，也有利于实现活体检测［1］。

荧光物质的发光强度常用激光诱导荧光技术(Laser induced fluorescence，LIF)［2］进行检测，而激光共聚焦扫描技术(confocal laser scanning，CLS)是共聚焦技术与LIF技术相结合的产物。LIF技术和CLS技术都采用激光作为发射荧光的激发光源，但是LIF技术中照明激光和发射荧光不通过同一物镜，激光往往对样本进行斜射照明，是场光源，如用于普通的荧光显微镜;而CLS技术中照明激光和发射荧光通过同一物镜，激光往往对样本进行垂直照明，是点光源［3］，如用于激光共聚焦显微镜。相对于LIF技术，CLS技术具有更高的分辨率［4］，并且可以实现深度荧光扫描。

根据CLS技术的工作原理，针对近红外荧光染料的光谱需求，设计了近红外荧光扫描所需的光学系统，并采用ZEMAX软件对光学设计进行了优化。

2 激光共聚焦工作原理

CLS光学系统利用激光束经照明针孔形成点光源，点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小光点。该点处的荧光物质被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿着原照射光路回送到由二向色镜构成的分光器，而分光器将荧光直接送到光电探测器。激光光源和光电探测器前方都各有一个针孔，分别是照明针孔和探测针孔，相对于焦平面上的光电，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。在荧光探测过程中，来自焦平面的光可以会聚在探测针孔的范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测针孔之外，这也是CLS光学系统具有很高的光学分辨率的原因。

CLS光学系统主要由照明光源、照明光滤光片、照明光聚焦透镜组、照明针孔、准直透镜组、二向色镜、物镜、发射光滤光片、发射光聚焦透镜组、探测针孔、光电探测元件等构成，如图1所示。

图1 激光共聚焦工作原理图Fig.1 Principle diagram of laser cenfocal

其中，LASER为用作照明光源的激光器;F1为照明光滤光片;F2为发射光滤光片;L1为照明光聚焦透镜组;L2为准直透镜组;L3为物镜;L4为发射光聚焦透镜组;A1为照明针孔;A2为探测针孔;D1为用于照明光和发射光分离的二向色镜，PMT为用于光电探测的光电倍增管。按照功能划分，CLS光学系统包括点光源光路、照明光路和发射光路两部分，其中点光源光路包括的光学元件为LASER、F1、A1，照明光路包括的光学元件为L1、L2、L3、D1，而发射光路包括的光学元件为L3、L4、D1、F2、A2、PMT。

3 光学系统的设计指标

CLS光学系统的照明光源是方向性、单色性很好的激光，采用平行入射的方式进行光学系统，因此在光学设计时只需校正轴上点，即0视场的球差。

物镜的数值孔径表征物镜的聚光能力，是物镜的重要性质之一，增强物镜的聚光能力可提高物镜的分辨率。数值孔径NA的计算公式如下:

其中，n为物镜与观察对象之间介质的折射率，如空气的折射率为1;θ为物镜的孔径半角。

数值孔径NA是显微镜物镜最主要的光学特性，它决定了物镜的衍射分辨率δ［5］，其计算公式为:

具体的设计指标要求如下:

1)视场角w=0°，只校正轴上点球差。

2)工作于近红外波段，其中照明激光光源的波长为780 nm，发射荧光的波长为820 nm。

3)采用点光源照明。

4)照明针孔直径50μm，探测针孔直径100μm，两种针孔的厚度都为0.2 mm。

5)光学分辨率小于2μm，由公式(2)计算可知需要数值孔径NA＞0.24。

4 具体光学设计过程

4.1 物镜(L3)光学设计

选择焦距为3.76 mm的复消色差显微物镜［6］作为初始结构，设置入瞳直径为14 mm，角度视场为0视场，工作波长为780 nm。由于本物镜只校正轴上点球差，因此通过设置优化函数进行球差校正，从而得到所需的物镜结构。优化函数的具体设置如下:

1)设置优化函数为“RMS(均方根)+Spot Radius(像点尺寸)+Centroid(质心点)”。

2)设置玻璃厚度边界条件为“Min=1，Max=4”。

3)设置空气间隔边界条件为“Min=1，Max=6”。

4)增加LONA和SPHA优化操作数，设置“Target=0，Weight=1”。

5)将所有面r值和d值都设计为变量。

6)将第一面的玻璃材料设置为变量(选择Slove Type类型为Substitute)。

采用“Optimization”进行自动优化，然后选择“Hammer Optimization”进一步锤形优化［7］。优化后的物镜结构参数如表1所示，其三维图、像差曲线、点列图分别如图2、图3、图4所示。图中可见，设计的物镜像差很小，焦点弥散斑的直径小于0.4μm，数值孔径较大为0.42，满足本CLS光学系统对数值孔径的要求。同时，物镜的结构也较为紧凑，总长为31.5 mm。

优化后的物镜的MTF曲线如图5所示，由于分辨率δ=2μm，可见其在N=1/δ=500 lp/mm时的MTF＞0.3［8］，因此该物镜具有极高的光学传送效率。

表1 优化后的物镜结构Tab.1 Object lens structure after optimization

图2 物镜的三维图与渲染图Fig.2 3D layout and shaded model of object lens

图3 物镜的像差曲线Fig.3 Ray fan of object lens

图4 物镜的点列图Fig.4 Spot digrams of object lens

图5 物镜的MTF曲线Fig.5 MTF of object lens

4.2 点光源光路(F1、A1)设计

CLS光学系统采用点光源作为照明光源，具有光源方向性好、发散小、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点，且与探测针孔及焦平面形成共聚焦装置。由于本系统采用带扩束准直镜且输出圆形激光光斑的直径为14 mm的光纤激光器作为光源，因此需要将其转换为点光源。为了简化光路和校正像差，选择类似于双胶合透镜结构的凹凸双透镜［9］来设计点光源光路。优化后的点光源光路结构参数如表2所示，三维图如图6所示，其中假设镀膜窄带滤光片的玻璃材料为BK7，厚度为1 mm。该点光源传输光路的焦距为39.6 mm，像方F#为1/2.8，像方数值孔径NA为0.17。

表2 点光源光路的初始结构Tab.2 Inital structure of point light source

图6 点光源光路的三维图与渲染图Fig.6 3D layout and shaded model of point light source

优化后的点光源光路的像差曲线、点列图、离焦点列图分别如图7、图8、图9所示，可见该光路的像差很小，焦点弥散斑的直径小于0.2μm，很好的模拟了光斑很小的点光源。另外，其在100μm处的离焦弥散斑的直径小于40μm，因此可以容易地通过厚度为0.2 mm、直径为50μm的照明针孔，满足照明针孔空间滤波的要求。

图7 点光源光路的像差曲线Fig.7 Ray fan of point light source

图8 点光源光路的点列图Fig.8 Spot digrams of point light source

图9 点光源光路的离焦点列图Fig.9 Thogh focus spot digrams of point light source

4.3 照明光路(L2、D1、L3)设计

为了简化光路，同样选择与点光源光路中相同的凹凸双透镜设计准直透镜组L2，并与二向色镜D1的反光面、物镜L3一起，构成照明光路，其结构参数如表3所示，三维图如图10所示。

设置准直透镜组L2的物方数值孔径与点光源光路像方数值孔径一致，为0.17，工作波长同样设置为780 nm，采用ZEMAX软件对照明光路进行仿真和分析，得到像差曲线、点列图、能量包围曲线分别如图11、图12、图13所示。仿真可见，该照明光路的像差很小，焦点弥散斑的直径小于1μm，且焦点弥散斑的能量在2μm范围内超过了83%，因此焦点光斑的能量集中度很高。

优化后的照明光路的MTF曲线如图14所示，可见其在500 lp/mm时的MTF＞0.4，因此该照明光路具有极高的光学传输效率。

图10 照明光路的三维图与渲染图Fig.10 3D layout and shaded model of lighting structure

表3 点光源光路的初始结构Tab.3 Initial structure of lighting structure

图11 照明光路的像差曲线Fig.11 Ray fan of lighting structure

图12 照明光路的点列图Fig.12 Spot digrams of lighting structure

图13 照明光路的能量包围曲线Fig.13 Encircled energy of lighting structure

图14 照明光路的MTF曲线Fig.14 MTF of lighting structure

4.4 发射光路(L3、L4、D1、F2)设计

为了校正像差，选择类似于柯克物镜［10］的结构设计发射光聚焦透镜组L4，并添加二向色镜的折射面，选择二向色镜D1和发射光滤光片F2的玻璃材质为BK7，得到其发射光路的初始结构。

设置物方数值孔径为0.42，与物镜的数值孔径一致，工作波长为820 nm，选择二向色镜和窄带滤光片的玻璃材料为BK7，采用ZEMAX软件对照明光路进行仿真和分析，可见其焦点弥散斑直径较大，MTF曲线的截止频率低于500 lp/mm。为了进一步校正该发射光路的像差，提高其截止频率，设置优化函数如下:

1)设置优化函数为“RMS(均方根)+Spot Radius(像点尺寸)+Centroid(质心点)”。

2)设置玻璃厚度边界条件为“Min=1，Max=6”。

3)设置空气间隔边界条件为“Min=1，Max=10”。

4)增加LONA和SPHA优化操作数，设置“Target=0，Weight=1”。

5)增加MTFS和MTFT优化操作数，设置“Samp=2，Wave=0，Field=1，Freq=500，Target=0.3，Weight=2”。

6)将发射光聚焦透镜组L4的所有面r值和d值都设计为变量，将其所有面的玻璃材料都设置为变量(选择Slove Type类型为Substitute)。

采用“Optimization”进行自动优化，然后选择“Hammer Optimization”进一步锤形优化，优化后的发射光路结构参数如表4所示。

表4 优化后的发射光路结构参数Tab.4 Parameters of emission structure after optimization

优化后的发射光路的三维图、像差曲线、点列图、离焦点列图分别如图15、图16、图17、图18所示。图中可见，设计的发射光路像差很小，焦点弥散斑的直径小于4μm。另外，其在100μm处的离焦弥散斑的直径小于100μm，因此能够通过厚度为0.2 mm、直径为100μm的探测针孔，满足探测针孔离焦滤波的要求。

图15 发射光路的三维图和渲染图Fig.15 3D layout and shaded model of emission structure

图16 发射光路的像差曲线Fig.16 Ray fan of emission structure

图17 发射光路的点列图Fig.17 Spot digrams of emission structure

图18 发射光路的离焦点列图Fig.18 Throgh focus spot digrams of emission structure

优化后的照明光路的MTF曲线如图19所示，可见其在500 lp/mm时的MTF≈0.3，因此该发射光路同样具有极高的光学传输效率。

图19 照明光路的MTF曲线Fig.19 MTF of emission structure

5 结论

设计了一种采用激光共聚焦技术的近红外荧光的扫描系统，采用复消色差显微物镜作为初始结构设计了物镜，采用凹凸双透镜结构设计了点光源光路和照明光路，采用柯克物镜作为初始结构设计了发射光路。其中，物镜的数值孔径为0.42;点光源光路的焦点弥散斑小于0.2μm，将圆形光斑激光很好地转换成了点光源，其离焦弥散斑的直径小于40μm，满足照明针孔的尺寸要求;照明光路的焦点弥散斑小于1μm，且焦点弥散斑的能量在2μm范围内超过了83%，因此焦点光斑的能量集中度很高;发射光路的离焦弥散斑的直径小于100μm，满足照明针孔的尺寸要求;同时照明光路和发射光路都具有较高的光学传输效率。因此，该光学系统具有数值孔径较大、工作于近红外光谱区、分辨率高的优点，可满足生物芯片、基因芯片等对激光共聚焦近红外荧光扫描系统的需求。

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